Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.
Скачать (прямая ссылка):
гибридизация на фильтрах_____________31
Перенос на фильтры небольшого количества бактериальных колоний г
Скрининг небольшого числа бактериальных клонов обычно проводится в двух случаях:
I. Если получено от 100 до 500 трансформантов на нескольких чашках.
П. Если заведомо известно, что выход интересующего рекомбинанта среди полученных трансформантов высокий.
Для переноса бактериальных колоний на нитроцеллюлозный фильтр и матричную чашку нарезают полоски из плотной бумаги (например, из перфокарт) размером I х 2 см и стерилизуют их сухожаром в чашке Петри при температуре 150°С в течение 1-1,5 ч.
1. Приготовьте две чашки с агаром, содержащим необходимый антибиотик. На поверхность агара одной из чашек поместите нитроцеллюлозный фильтр (НЦФ), предварительно стерилизованный УФ-светом. Фильтр и матричную чашку необходимо ориентировать, пометив их фломастером. Если шаблон нанесения бактериальных колоний асимметричен, то необходимость в ориентации НЦФ и матричной чашки отпадает.
2. Перенос бактериальных колоний на НЦФ и матричную чашку осуществляйте уколом по шаблону уголком полоски бумаги (можно использовать оба уголка полоски).
3. Положите чашки в термостат на 37°С вверх дном. Инкубируйте до появления 1-2 мм-колоний.
4. Снимите НЦФ с выросшими колониями нестерильно. Обработайте НЦФ по ниже описанной методике. Матричную чашку замотайте парафильмом и храните в холодильнике.
гибридизация на фильтрах____________32
Примечание. Для получения достоверных результатов гибридизации на НЦФ необходимо нанести несколько клонов бактерий с исходна* вектором в качестве негативного контроля. Если гибридизацию нужно вести с несколькими зондами, то высев-трансформантов можно производить на соответствующее количество НЦФ. Можно также последовательно гибридизовать один НЦФ с каждым зондом с последующей отмывкой от предыдущего специфично связавшегося зонда. Отмывку зонда можно производить в 2xSSC при температуре плавления образовавшегося в результате гибридизации дуплекса.
Перенос на фильтр! большого количества бактериальных колоний
Этот вариант скрининга обусловлен низким выходом интересующего рекомбинантного клона. Высев колоний в этом случае можно производить до нескольких десятков тысяч на 90-мН чашку (лучше не более 30 ООО). Вместо нитроцеллюлозы для переноса бактериальных клонов лучше использовать бумагу Whatman 542 (или 540, 541), так как в этом случае не требуется исключительных навыков по одергиванию колоний с агара и, в отличие от НЦ$, не возникает проблем с неполным или неравномерным отпечатыванием колоний на фильтре. Гибридизацию зонда с ДНК, иммобилизованной на бумажных фильтрах проводят гак же, как и в случае с НЦФ (см. далее).
1. Вырезанные по размеру чашки бумажные диски Whatman 542 стерилизуйте УФ-светом в течение 20-30 мин. Диски должны быть заранее подписаны шариковой ручкой или простым карандашом.
2. Достаньте чашки из термостата. Стерильным пинцетом поместите бумажный диск на поверхность агара с колониями и быстро прижмите его пинцетом по всей площади. Намокание диска должно быть равномерным и одновременным во избежание его деформаций, препятствующих нормальному переносу бактериальных колоний. Следите за тем, чтобы между агаром и диском не было пузырьков воздуха.
гибридизация на фильтрах _____________33
3. С помощью стерильной препаровальной иглы сделайте сквозные уколы, оставляющие заметный след на агаре. Уколы должны быть асимметричны для однозначной ориентации фильтра относительно чашки.
4. Фильтр осторожно снимите с агара, чашку закройте и поставьте в термостат на 37°С. Через 1-2 суток матричную чашку достаньте из термостата, замотайте парафильмом и храните в холодильнике до получения результатов гибридизации.
5. Фильтр с отпечатанными колониями обработайте согласно описанной ниже методике.
Примечание. Для получения нескольких реплик с одной матричной чашки необходимо бумажный фильтр с иммобилизованными бактериальными колониями отпечатать на нитроцеллюлозный фильтр, помещенный на агар с нужным антибиотиком. После получения "сэндвича" необходимо сделать проколы НЦФ через маркерные отверстия на бумажном фильтре. Чашки с нитроцел-люлозными фильтрами поставьте в термостат на 37°С вверх дном.
В. Перенос на фильтры бляшек бактериофага А-
В зависимости от поставленной задачи на одну чашку высевается 10^-10^ бляшкообразующих частиц. Чашки с агаром необходимо готовить за двое суток до эксперимента. Для высева адсорбированного бактериофага целесообразно верхний агар заменить на верхнюю агарозу, так как при переносе бляшек ка НЦФ верхний агар часто отрывается от нижнего.
1. Достаньте чашку с бляшками фага А> из термостата и положите ее в холодильник на 1-2 ч.
2. Пометьте НЦФ шариковой ручкой с обратной стороны и стерилизуйте его УФ-светом в течение 20-30 мин.
гибридизация на фильтрах_________._____34
3. Налайте НЦФ на газон с бляшками. Следите за тем, чтобы меаду фильтром и верхней агарозой не было пузырьков воздуха, препятствующих переносу бактериофага % на фильтр.
