Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.
Скачать (прямая ссылка):
Конформация ДНК. Суперекрученная, кольцевая и линейная молекулы ДНК имеют различную подвижность в агарозных гелях. Их относительная подвижность зависит от концентрации геля, напряженности поля, ионной силы буфера. Обычно максимальную подвижность имеет суперскрученная форма, затем линейная, а минимальную - кольцевая.
Приготовление агарозного геля
1. Смешайте необходимые количества агарозы, концентрированного электродного буфера и воды (для агарозных гелей обычно используют ТАЕ, но можно использовать и ТБЕ).
2. Нагрейте на водяной бане или на плитке при постоянном перемешивании до полного растворения агарозы.
3. Остудите раствор приблизительно до 50°С (Т°, которую терпит рука). На этом этапе можно добавить бромистый этидий до концентрации 0,5 мкг/мл. В этом случае не надо окрашивать гель после проведения электрофореза.
4. Приготовьте ванночку для заливки геля и установите в ней гребенку для формирования карманов таким образом,
электрофорез ДНК_____________22
чтобы между зубьями гребенки и дном ванночки остался просвет около I мм.
5. Залейте расплав геля в ванночку и оставьте до полной полимеризации геля.
6. Аккуратно выньте гребенку и перенесите гель в камеру для электрофореза.
7. Залейте в камеру электродный буфер так, чтобы слой буфера над гелем был около I мм. В буфер можно добавить бромистый этидий до концентрации 0,5 мкг/мл.
8. Добавьте в анализируемые образцы 1/10 объема раствора, содержащего 50? глицерин, 0,2% бромфеноловый синий и/ или ксиленцианол, тщательно перемешайте и нанесите в карманы.
9. Бодайте необходимое напряжение на электроды. ДНК движется от (-) к (+) .
Электрофорез ДНК в полиакриламидных гелях
Для разделения фрагментов ДНК длиной менее I т.п.н. используют ПААГ 2-х типов: нативный (без мочевины) для разделения двухцепочечных фрагментов и денатурирующий, содержащий 6-8 М мочевину, - для разделения одноцепочечных фрагментов.
В таблице 3 приведен диапазон-эффективного разделения фрагментов ДНК при различных концентрациях геля.
Эффективность разделения. Подвижность фрагментов ДНК в денатурирующем ПААГ зависит от их состава. Напряжение, при котором ведется электрофорез, не имеет принципиального значения. При проведении электрофореза в нативных услови-
электрофорез ДНК____________23
ях следите за тем, чтобы гель не перегревался, т.к. это может привести к плавлению цепей низкомолекулярных фрагментов. При проведении электрофореза в денатурирующих условиях разогрев геля даже желателен, но чрезмерно большой ток может привести к искривлению фронта и растрескиванию стекла.
Таблица 3
диапазон разделения (п.н., н.)
% АА
нативный ПААГ денатурирующий ПААГ
3,5 100-1000
4 200
5 80- 500 80-200
8 60- 400 40-100
12 40- 200 10- 50
20 10- 100 20
Подвижность ДНК в ПААГ. О разделении фрагментов ДНК в ПААГ можно судить по положению маркерных красителей. В таблице 4 приведены размеры ДНК, мигрирующие с маркерными красителями в ПААГ различной концентрации.
Таблица 4
% геля нативный ПААГ денатурирующий ПААГ
ВР ХС ВР ХС
3,5 100 460
5 65 260 35 130
6 26 106
8 45 160 19 70-80
10 12 55
12 20 70
20 12 45 8 28
электрофорез ДНК_____________24
Разделяющая способность ПААГ довольно высока. На I мм*" площади дна кармана может быть нанесено до 0,1 мкг ДНК.
Приготовление ПААГ
1. Для ПААГ используют ТБЕ-буфер.
2. Раствор мономеров: обычно готовится 30% или 40% раствор с соотношением АА/бисАА = 30/1. Раствор хранится длительное время при 4°С.
30% р-р 40% р-р
акрил амид 29 гр 38,7 гр
метиленбисакриламид I гр 1.3 гр
вода до 100 мл до 100 мл
Примечание, акриламид токсичен. Работайте в перчатках.
3. Приготовьте 10% водный раствор персульфата аммония (ПСА).
Примечание. ПСА быстро разлагается в водных растворах. Для приготовления раствора старайтесь брать не обводненные партии кристаллического ПСА. Раствор хранится при 4°С не более недели.
Для приготовления нативного ПААГ рассчитайте и смешайте необходимое количество раствора мономеров, концентрированного электродного буфера и воды. Добавьте I/I00-I/500 объема 10% ПСА. Профильтруйте раствор под вакуумом через ватман или стеклянный фильтр типа GF/A, GF/B, GF/C,
Для приготовления денатурирующего ПААГ проведите аналогичный расчет, смешайте необходимое количество мочевины (конечная концентрация в геле должна быть 6-8 М), мономеров и воды. Для деионизации мономеров и мочевины добавьте смесь ионообменных смол типа Amberlite. Оставьте при пос-
