Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Мазин А.В. -> "Методики для работ по генетической инженерии" -> 2

Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.

Мазин А.В., Кузнеделов К.Д. Методики для работ по генетической инженерии — Новосибирск, 1986. — 61 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikidlyarabotgenetiche1986.djvu
Предыдущая << 1 < 2 > 3 4 5 6 7 8 .. 16 >> Следующая

диффузии в буфер ..................-..... 40
Е, Химические реглцк» расщепления /ЩК .... 41
К. Определение первичной структуры ДНК методом Мзнегша-Гйяберта с использованием ацетонсвогс осаядения (Холодилов Б.Г. К..................
}-, Злвктроэлоцмя ДНК кз полиакриламидного
Г К Sir, .................................4Ь
B. Хйшческие реакции расщепления ДНК .... 46
Ш. Метод определения нуклеотидной последовательности ДИК по М&кеаму-Гилберту на твердой фазе (Федоров С.П.) .................................. 48
А.. Эяектроэлоция ДНК из геля на РЕАЕ-
целлюлозу ................................ 4S
Б. Химические реакции расщепления ДНК ....
заноешь.......... ................................ 5?
1ЖООК ЛИТЕРАТУРУ
ВЬЩЕЛЕНИЕ ДНК ПЛАЗМИД И БАКТЕРИОФАГОВ
I. Выделение ДНК фага А/
1. Фаговую бляшку размером 3-4 мм вырежьте из агара и суспендируйте в 500 мкл SM буфера.
SM буфер:
100 мМ NaCl 10 мМ MgS04 (Mgci2)
20 мМ грис-HCl, Рн 7.5
0.01% желатин
2. Для высвобовдения фаговых частиц из агара фаговую суспензию инкубируйте I час при 37°С.
3. К фаговой суспензии добавьте 20-50 мкл ночной культуры E.coli (D550 = I-I.5 о.е.) и инкубируйте 10-15 мин
для адсорбции фага на клетках. Для наработки фагов используйте следующие штаммы E.coli: К-802, DP-50, LB-392 и др.
4. Инфицированные фагом клетки внесите в 200-500 мл среды LB (см. приложение), содержащей 10 мМ MgSO^ (MgCi2) и
инкубируйте 8-12 часов до полного лизиса клеток на качалке при 37°С. Затем добавьте 2-3 мл хлороформа и инкубируйте еще 10-15 мин в тех же условиях.
5. Клеточный дебрис удалите центрифугированием на центрифуге J2-21 в роторе JA-10, 10 мин, 7 000 об/мин, 4°С. Осадок удалите, к супернатанту добавьте панкреатическую
выделение ДНК
2
ДНКазу и РНКазу до конечной концентрации 10 мкг/мя и инкубируйте I час при 37°С (можно использовать отечественные препараты нуклеаз).
6. Добавьте к лизату ПЭГ 6 ООО до конечной концентрации 1056, растворите на магнитной мешалке, и NaCl до конечной концентрации I II и оставьте на ночь в холодильнике до образования осадка фаговых частиц. Все указанные выше процедуры проводите в центрифужных стаканах для ротора JA-Ю или ротора JA-14 в зависимости от объема фагового лизата.
7. Саговые частицы соберите центрифугированием, 10 ООО об/ мин, 10 мин, 4°С. Супернатант удалите, осадок суспендируйте в 3-5 мл SM буфера, затем добавьте равный объем хлороформа и энергично перемешайте в течение 30 сек. Далее центрифугируйте в любом бакет-роторе 5 мин, 3 000 об/мин при комнатной температуре. Соберите водную фазу, содержащую фаговые частицы.
8. Добавьте к фаговой суспензии кристаллический CsCi (на
I мл суспензии - 0,5 г CsCl). После растворения хлористого цезия нанесите фаговую суспензию на ступенчатый градиент СвС1 приготовленный на SM буфере в нитроцел-люлозных пробирках для ротора sw-28. Градиент состоит из трех ступеней, с плотностью 1,7; 1,5 и 1,45 г/мл. Центрифугируйте 2 часа, 22 000 об/мин при 4°С. Фаговые частицы будут расположены на границе между слоями с плотностями 1,45 и 1,5 г/мл.
9. С помощью толстой иглы проколиуе центрифужную пробирку и соберите фаговые частицы.
10. Удалите хлористый цезий с помощью диализа против I 000-кратного избытка SM буфера. Диализ проводите 3 раза по
I часу при комнатной температуре без перемешивания.
выделение ДНК
3
11. Перенесите фаговую суспензию f центрифужную W
добавьте ЭДТА до конечной концентрации 20 idi, SDS -
до 0,5? и протеиназу К до 50 мкг/мл и инкубируйте 30-60 мин при 65-68°С.
12. Белки фаговой оболочки удалите четырьмя последовательными экстракциями: фенолом, смесью фенола с хлороформом 5:1, смесью фенола с хлороформом 1:1, хлороформом.
Для экстракции используйте фенол, перегнанный и насыщенный трис-НС1, pH 8,0. Хлороформ используйте с добавлением 1/25 части изоамилового спирта.
13. ДНК фага А- осадите из водной фазы добавлением равного объема изопропанола в присутствии 0,3 М ацетата натрия, резко переворачивая пробирку до образования осадка ДНК. Осадок ДНК удалите из пробирки пинцетом, промойте в 70% этаноле, подсушите и растворите в соответствующем объеме ТЕ-буфера (10 idi трис-HCi, pH 7,8 и I мМ ЭДТА).
В зависимости от степени лизиса клеток, с 200 мл лизата удается получить от 100 до 500 мкг ДНК. При наработке фага Л в аналитических количествах (5-10 мл фагового лизата) используйте те же процедуры, что и при препаративной наработке, исключая пункты 8, 9, 10.
выделение ДНК
4
1. 1,5 мл ночной культуры перенесите в эппецдорфовскую пробирку, центрифугируйте 3 мин, супернатант удалите с помощью водоструйного насоса.
2. К осадку добавьте 100 мкл раствора I и тщательно суспендируйте.
Rsictbop I
25 мМ трис—НС1 (рН-8,о)
Предыдущая << 1 < 2 > 3 4 5 6 7 8 .. 16 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed