Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.
Скачать (прямая ссылка):
Обычно активность ферментов выражается в относительны* единицах, где за I ед. принято количество фермента, необходимое для полного гидролиза I мкг ДНК фага А> в теченяв I часа при 37°С.
Поскольку размер ДНК фага А, известен, можно, зная количество сайтов рестрикции для той или иной рестриктазы, выразить активность фермента в молях сайтов за час и, исходя из этой величины, рассчитать количество фермента, необходимое для гидролиза какой-либо иной ДНК, отличной от ДНК фага А.
Пример:
Ваш HI
ДНК 48,5 т.п.н. 5 сайтов
ДНК рШ322 4,3 т.п.н. I сайт
Количество фермента, необходимое для гидролиза
I мкг pBR 322 в течение I часа при 37°С =
48.5 х I г> п __
= 4|b'x b = 2’3 ед*
Не стоит брать большой избыток фермента, т.к. практически любой из них загрязнен другими экзо- и/или эндонуклеазами. Поэтому добавление в реакционную смесь большого избытка фермента приводит лишь к неоправданному увеличению степени деградации препарата ДНК.
Ферменты непосредственно перед использованием можно разбавлять реакционным буферным раствором. Если предполагается длительное хранение разбавленного препарата, для разбавления используют буфер хранения (состав указывает предприятие изготовитель фермента), содержащий 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, свободного от луклеаз.
гидролиз ДНК рестриктазами______________10
Уеаошя рестрикции
Обычно реакционная смесь содержит 0,1-5 мкг ДНК в объеме 10-50 мкл. Реакцию проводят в оптимальном для данной рестриктазы буфере (см., например, "Methods of Enzymology" Ў. 100, p. 3 или каталоги фирм BioLabs, BRL и др.).
Несмотря на разнообразие рестриктаз, для большинства ¦а них можно использовать один из 3-х, приведенных в таблице I буферных растворов.
Таблица I
I х буфер HaGl trie-HCl pH 7.5 MgCl2 2-меркаптоэтанол
Low 0 10 idi 10 mU 5 mM
Medina 50 idi 10 idi 10 idi 5 mU
High 100 idi 50 mH 10 mM 5 mM
В таблице 2 приведен перечень наиболее употребимых рестриктаз с указанием зависимости активности от концентрации соли, оптимального буфера, сайта рестрикции и их количества в ДНК фага А- и pBR 322.
Проведение реакции
*
Реакцию обычно проводят в пластиковых пробирках объемом
0,5 или 1,5 мл. Большое количество реакций удобно проводить в титровальных платах, однако в этом случае надо по возможности свести к минимуму испарение воды из реакционных смесей.
1. В пробирку с ДНК добавьте стерильной воды или ТЕ до объема 18 мкл.
2. Добавьте 2 мкл 10 х кратного буфера рестрикции и перемешайте.
3. Добавьте необходимое количество фермента и быстро перемешайте.
гидролиз ДНК реетриктазами____________И
4. Поместите пробирку в термостат и инкубируйте необходимое время.
5. Остановите реакцию добавлением ЭДТА до концентрации 10 мМ.
!!! Помните: рестриктазы быстро инактивируются при комнм-ной температуре. Храните ферменты в морозильной камере. Вынув фермент из холодильника, немедленно поставьте его в лед. Отбирать фермент необходимо новым или, в крайнем случае, автоклавированным носиком. Объем добавляемого, фермента не должен быть больше 1/10 объема реакционной смеси, т.к. в противном случае реакция может ингибироваться глицерином.
Метилирование ДНК
В ДНК могут быть метилированы основания цитозина и едено зина. В некоторых случаях это приводит к тому, что ДНК не разрезается той или иной рестриктазой. Так ДНК многих млекопитающих, не разрезается SalGl , а ДНК E.coli плазмид и фагов не гидролизуется БсоНП, поскольку большинство используемых штаммов E.coli содержат dcm-метилазу, метилирующую внутренний цитозин в последовательности cc(a/t)gg.
В случае необходимости рестрикции по EcoRlI сайтам необходимо провести плазмиду или фаг через <1сш~ штамм E.coli или использовать рестриктазу BstNI узнающую эти сайты, но не чувствительную к метилированию.
Метилирование ДНК in vitro часто используется при проведении генно-инженерных работ. В настоящее время в Институте доступны: BamHI метилаза, метилирующая внутренний цитозин в последовательности GGATiSc и EcoRI метилаза, метилирующая аденозин в последовательности GA&TTC. После метилирования ДНК не разрезается соответственно BamHI и EcoRI.
Реакцию проводят в буфере следующего состава: 10 мМ трис-НС1 pH 7,5 для BamHI метилазы или 100 мМ трис- НС1 pH
гидролиз ДНК рестриктазами__________ 12
8,0 для EcoRI метилазы, 10 idl ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 80 мкМ в-аденозилметионин. За единицу активности принято количество фермента, необходимое для полного метилирования всех сайтов рестрикции I мкг ДНК фага X при 37°С в течение I часа.
Таблица 2
гидролиз ДНК рестриктазами______________13
Рестриктаза концентрация тип сайт % pBR 322
ИаС1 (мМ) буфера рестрикции
