Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.
Скачать (прямая ссылка):
электрофорез ДНК_____________25
тоянном перемешивании на 0,5-1 час при комнатной температуре. Профильтруйте под вакуумом необходимое количество концентрированного электродного буфера, затем раствор мономеров с мочевиной. К фильтрату добавьте i/I00-1/500 объема 10% ПСА.
Полимеризация геля
1. Для полимеризации геля добавьте ТЕМВД из расчета 30 мкл на 100 мл геля. Быстро перемешайте и залейте без пузырей между заранее приготовленными стеклами.
Метод заливки геля не имеет принципиального значения и различается в разных лабораториях и группах. Поэтому в настоящем пособии не описывается.
2. Вставьте гребенку для формирования карманов и оставьте до полимеризации геля, которая обычно проходит за 5-15 мин, но не более часа.
3. Выньте гребенку, от остатков незаполимеризовавшегося акриламида немедленно промойте карманы дистиллированной водой.
4. Установите гель в камеру для электрофореза, заполненную ТЕЕ буфером, и подайте напряжение на электроды.
5. Проведите преэлектрофорез (I час или более).
6. По окончании преэлектрофореза промойте карманы, нанесите образцы и подайте напряжение на электроды.
Приготовление образцов
I. При проведении электрофореза в денатурирующих условиях растворите образец в 9056 формамиде, содержащем 0,02% маркерных красок. Прогрейте на кипящей бане I мин, быстро остудите, после чего нанесите на гель.
электрофорез ДНК_____________26
При проведении электрофореза в нативных условиях добавьте к образцу 1/10 объема раствора, содержащего 505S глицерин, 0,2% бромфеноловый синий и/или ксиленцианол, перемешайте и нанесите на гель.
ТРАНСФОРМАЦИЯ E.COLI МН-1 ПЛАЗМИДНОЙ ДНК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХЛОРИСТОГО МАРГАНЦА
В настоящее время методы трансформации клеток E.coli плазмид-ной ДНК получили значительное распространение. Широко используются методы трансформации, в основе которых лежит получение компетентных клеток E.coli с помощью хлористого кальция и хлористого рубидия (Маниатис и др., 1965).
Данная методика воспроизводимо дает 5-I07 трансформантов на I мкг суперскрученной ДНК pBR 327.Компетентные клетки штамма МН-1 можно приготовить в больших количествах (100-200 фасовок) и хранить замороженными без потери в эффективности трансформации по крайней мере в течение нескольких месяцев.
А. Подготовка компетентных клеток
1. Внесите I мл ночной культуры МН-1 (гее А+) производный JM в 500-мл колбу со 100 мл LB. Наращивайте клетки при 37°С с интенсивным перемешиванием до Д^ =0.3.
2. Соберите клетки центрифугированием при 4000 об/мин, 10 мин, 0°С.
3. Отбросьте супернатант и суспендируйте клетки в 25 мл ледяного (0-4°С) буфера I.
4. Соберите клетки центрифугированием при 4000 об/мин, 10 мин, 0°С.
5. Удалите супернатант как можно более полно и суспендируйте клетки в 5 мл ледяного буфера II.
6. Расфасуйте клеточную суспензию по 200 мкл в предваритель-
трансформация
28
но охлазденные стерильные пластиковые микропробирки и поставьте их замораживаться в морозильник на -70°С (можно на -50°С). Хранить компетентные клетки следует при температуре замораживания.
Примечание. Операции, перечисленные в пп. 3, 5, 6,выполняются на льду и,чем быстрее они будут проведены, тем лучше. Необходимо также помнить, что клетки становятся компетентными только после замораживания.
Трансформация
1. Оттайте на льду пробирку с компетентными клетками. Эта стадия не является критической и после оттаивания клетки можно оставлять на льду до I часа.
2. Перенесите клеточную суспензию в предварительно охлажденную тонкостенную пробирку (стеклянную) и добавьте ДНК (не более 25 нг) в объеме не более 40 мкл. Перемешайте суспензию.
3. Инкубируйте реакционную смесь на льду в течение 30 мин.
4. Поместите пробирку в термостат на 42°С и инкубируйте 2 мин.
5. Добавьте I мл LB и инкубируйте I час без перемешивания при 37°С.
6. Высейте на соответствующую селективную среду.
трансформация
29
Буфер!
Буфер I
30 мМ КАс 50 мМ МпС12 10 мМ СаС12 100 мМ КС1 15% глицерин pH 5.8
Буфер II
10 мМ MOPS 10 мМ КС1 75 мН СаС12 15% глицерин pH 6.5
Стерилизуйте буфер! фильтрованием через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0.2 мхм. Буфер I перед стерилизацией необходимо профильтровать для удаления нерастворившего-ся МпС12#
Примечание. Перед тем, как приготовить компетентные клетки в большом количестве, вырастите их в 20 мл LB и поставьте пробную трансформацию для проверки качества буферов. При увеличении или уменьшении объема наращиваемых клеток соответственно изменяйте объемы буферов.
ДЕТЕКЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
Гибиридизация между комплементарными нитями нуклеиновых кислот стала одним из мощных инструментов молекулярной биологии. Метод основан на том, что две комплементарные нити в двойной спирали ДНК или ДНК/РНК дуплексе можно разделить денатурацией, а затем отжечь (гибридизовать) в условиях, благоприятных для образования водородных связей между основаниями. Одним из самых общеупотребимых применений методов гибридизации являются процедуры in situ, где одна из отжигаемых нитей иммобилизована. Многое в этой процедуре основано на использовании нитроцеллюлозы для иммобилизации ДНК (Hygaard, 1964). Саузерн (1975) и Элвин (1977) ввели оригинальные варианты основной процедуры. Обычно комплементарная меченная нить добавляется как растворимый зонд который после гибридизации можно локализовать авторадиографией Быстрота, высокая чувствительность, технологическая простота метода гибридизации нуклеиновых кислот на твердом носителе сделали его незаменимым в практике генетической инженерии для скрининга рекомбинантных клонов. Обсуждаемый метод позволяет одновременно проводить скрининг до десятков, сотен тысяч индивидуальных клонов. Скрининг рекомбинантных клонов методом молекулярной гибридизации in situ можно разбить на два самостоятельных этапа, которые разносятся по времени на удобный для экспериментатора срок. Первый этап связан с иммобилизацией ДНК на твердой фазе. Второй - относится к собственно гибридизации иммобилизованной ДНК с меченным зондом.
