Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Мазин А.В. -> "Методики для работ по генетической инженерии" -> 10

Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.

Мазин А.В., Кузнеделов К.Д. Методики для работ по генетической инженерии — Новосибирск, 1986. — 61 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikidlyarabotgenetiche1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 4 5 6 7 8 9 < 10 > 11 12 13 14 15 .. 16 >> Следующая

4. После того, как фильтр полностью намокнет, проделайте
в нем маркерные сквозные отверстия с помощью стерильной препаровальной иглы. След от иглы на чашке должен быть заметным.
5. Осторожно снимите фильтр с чашки и положите его на фильтровальную бумагу бляшками кверху. Далее обработку фильтров проводите согласно описанной ниже процедуре.
Примечание. С одной чашки можно снять до семи реплик. Время адсорбции для каждой последующей реплики необходимо увеличивать. Для получения достоверной информации о гибридных клонах необходимо с каждой чашки снимать по две реплики. Получив информацию о гибридизации на двух фильтрах, нужно сравнить позитивные сигналы и отбросить те, которые не совпадают на обоих фильтрах как неспецифические сигналы.
Амплификация бактериофага A' in situ
Процедура не лишена смысла особенно в том случае, когда зонд имеет низкую удельную радиоактивность или частичную гомологию с ДНК интересующего клона. Амплификацию бактериофага А, проводят на НЦ$.
1. Стерильные НЦФ, подписанные с обратной стороны, окуните
в суспензии магниевых клеток -бактерий-хозяев с оптической плотностью d55o = о,2-0,3. Фильтры подсушивайте на стерильной фильтровальной бумаге в течение 0,5-1 ч.
2. Перенос бактериофага на НЦФ, импрегнированные бактериями, осуществляйте согласно пп. 3, 4 предыдущей главы.
гибридизация на фильтрах_____________35
3. Отпечатанные фильтры поместите на свежем агаре бляшками вверх и инкубируйте в термостате на 37°С в течение 12-16 ч. Матричные чашки обмотайте парафильмом и храните
в холодильнике до получения результатов гибридизации.
4. Снимите НЦФ с чашек нестерильно и обработайте их согласно описанной ниже методике.
Подготовка фильтров для гибридизации
Для гибридизации ДНК бактерий и бактериофага с меченным
зондом необходимо высвободить ДНК, денатурировать и зафиксировать ее на фильтре.
1. Лизис клеток и фаговых частиц проводите на листе фильтровальной бумаги, обильно смоченной 0,5 М NaOH. В зависимости от количества фильтров эту процедуру можно выполнять либо в чашке Петри, либо в лотке. Фильтры кладите колониями и бляшками вверх. Следите за тем, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Денатурацию проводите в течение 5 мин. при комнатной температуре. После этого положите фильтры на сухой лист фильтровальной бумаги, чтобы удалить остатки щелочи.
2. Нейтрализацию проводите в I М трис-НС1, pH 8.0 по той же технологии, что и денатурацию.
3. Положите фильтры на фильтровальную бумагу, смоченную 2xSSPE (20XSSPE - 3,6 М NaCl, 200мМ NaHgPO^, pH 7,4,
20 мМ ЭДТА) или 2xSSC (20XSSC - 3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, pH 7.0) на 5 мин. Перенесите фильтры на сухую фильтровальную бумагу, дайте им подсохнуть в течение 10-15 мин.
4. Поместите фильтры между двумя листами Whatman 3 ММ. Фиксацию ДНК проводите при 80°С в вакууме в течение I
ч. После сушки фильтры можно хранить в вакууме при ком-
гибридизация на фильтрах______________36
натной температуре сколь угодно долго.
Е. Гибридизация ДНК, иммобилизованной на фильтрах, с меченными зондами
Гибридизация с олигонуклеотидными зондами (не более 50 нуклеотидных звеньев).
1. Рассчитайте температуру гибридизации (Тр) по одной из следующих формул:
(а) Тг = 2S(A + Т) + 3S(G + С)
(б) Тг = 2 ? (А + Т) + 4 ?(о + С) - 5
(в) Тг = 1,24 Тпл - 43,8
где Тпл - температура плавления
Тщ, = 81,5°С + 16,6 lg[Na+J + 0,4I(56g + С) -
- 500/п - 0,61(% фомамида), где п - количество нуклеотидов в дуплексе.
2. Положите фильтр с иммобилизованной ДНК на поверхность раствора для гибридизации (6xSSC раствор,Денхардт х I, 25мкг/мл суммарной РНК из дрожжей). После полного намокания фильтр утопите. Меченный зонд добавляйте при Тг гибридизационного раствора. Гибридизацию проводите в течение 30-40 мин.
Раствор Денхардта (50 х) фикол I г
поливинилпирролидон I г BSA (Pentax FractionY) I г HgO до 100 мл
Храните при -20°С
гибридизация на фильтрах_____________37
3. Отмойте фильтры от несвязавшегося зонда в следующем режиме: 3 раза по 10 мин при комнатной температуре в 5ж ssc в объеме 50 мл на один фильтр размером 10 см в диаметре; инкубация при Тг в 5xSSC в течение 30 мин.
4. Удалите остатки жидкости с фильтров на фильтровальной бумаге. Зафиксируйте фильтры на стекле с помощью клейкой ленты. Накройте их лавсановой пленкой (Saran Wrap). Для ориентации фильтров сбоку наклейте полоску бумаги с радиоактивным рисунком (лучше всего использовать чернила с изотопом С). Приложите рентгеновскую пленку к стеклу с фильтрами. Накройте сверху вторым стеклом для полного контакта. Экспонируйте несколько часов.
5. После проявления совместите пленку с фильтрами с помощью радиоактивного рисунка. Фломастером на пленке отметьте положение маркерных отверстий на фильтре. Обведите контуры фильтров (если они не видны на пленке). Разрежьте пленку по контурам. Прикладывая пленку к чашкам, локализуйте клон, соответствующий позитивному сигналу на пленке. Бели засев плотный, необходимо выколоть зону вокруг сигнала и сделать рассев для повторной гибридизации.
Предыдущая << 1 .. 4 5 6 7 8 9 < 10 > 11 12 13 14 15 .. 16 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed