Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.
Скачать (прямая ссылка):
50 мМ глюкоза 20 мМ ЭДТА
2 мг/мл лизоцим
Хранить при +4 ч8°С
3. Сразу же добавьте 200 мкл раствора 2, осторожно перемешайте, переворачивая пробирку. Суспензия должна просветлеть и стать более вязкой.
Rsictbop 2
0,2 Н НаОН 1% SDS
Хранить при комнатной температуре
4. Добавьте 150 мкл 3 М ацетата натрия (pH 5,0), хорошо перемешайте и центрифугируйте 5 мин.
5. Осадок удалите из пробирки обратным концом спички.
К супернатанту добавьте I мл 96%-го этанола и тщательно перемешайте. Выдержите при комнатной температуре 5-10 мин.
выделение ДНК
5
6. Центрифугируйте 3 мин, супернатант удалите, осадок слегка подсушите и растворите в 100 мкл буфера ТЕ.
7. К раствору ДНК добавьте равный объем 5 II раствора хлористого лития, перемешайте и поместите в лед на 15 мни. Центрифугируйте 5 мин.
Примечание. При скрининге большого количества плазмид можно до обработки хлористым литием провести анализирующий электрофорез в 1%-ом агарозном геле и обрабатывать только те клоны, которые Вас устраивают.
8. Супернатант перенесите в чистую пробирку и добавьте I мл 96%-го этанола. Вцдержите при -20°С 5-10 мин и центрифугируйте 5 мин.
9. Супернатант удалите, осадок высушите и растворите в 100 мкл ТЕ-буфера. Полученная этим методом плаэмидная ДНК пригодна для рестрикционного анализа, гибридизации и определения последовательности нуклеотидов
выделение ДНК
6
I. Вцделение плаэмидной ДНК центрифугированием в двухступенчатой градиенте хлористого цезия
А. Взращивание бактерий и амплификация плазмидной ДНК
1. Бактериальную колонию инокулируйте в 10 мл питательной среды, содержащей соответствующий антибиотик, и, интенсивно встряхивая, инкубируйте ночь при 37°С.
Примечание. Обычно используют среду LB или М9, обогащенную казаминовыми кислотами до 5-15 г/л (см. приложение).
2. Инокулируйте 0,1 мл ночной культуры в 25 мл питательной среды с антибиотиком и инкубируйте на качалке при 37°С, пока D600 не достигнет 0,6.
3. Инокулируйте 25 мл культуры в 500 мл питательной среды, нагретой до 37°С и инкубируйте на качалке при 37° до
4. Добавьте к бактериальной культуре I мл раствора хлорам-феникола (85 мг/ыл в этаноле) до конечной концентрации антибиотика 170 мкг/мл.
Получение осветленного лизата (Clewell, Helinski, 1969)
I. Клетки из одного литра культуры E.coli осадите центрифугированием на J2-21 (ротор' JA10 ) 7 000 об/мин в течение 15 мин.
2. Осадок ресуспендируйте в 50-100 мл 50 мМ трис-HCl, рн
8,0 и вновь осадите клетки центрифугированием.
вццеление ДНК
7
3. Осадок культуры ресуспендируйте при 0°С в 6 мл раствора, содержащего 50 мН трис-НС1,рн 8,0 и 25% сахароан.
4. К суспензии клеток добавьте I мл раствора лизоцима 2 мг/мл в 250 idi трис-HCi pH 8,0. Тщательно, но осторожно перемешайте. Инкубируйте при 0°С. Время инкубации для различных штаммов E.coli может варьировать от 2 до 10 мин и его подбирают эмпирически.
5. Добавьте I мл 0,4 М ЭДТА (pH 8,0), осторожно перемешайте и инкубируйте при 0°С I мин.
6. Суспензию обработанных лизоцимом клеток прилейте тонкой струей при непрерывном перемешивании к 8 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-ЯС1 pH 8,0, 5 мМ ЭДТА и 2% тритона Х-100 при 0°С. Полученный лизат сразу же центрифугируйте на J2-21 ротор JA-20 при 4°С 18 ООО об/мин в течение часа.
В. Приготовление градиента CsCl и центрифугирование
1. Добавьте в осветленный лизат водный раствор бромистого этидия (10 мг/мл) до концентрации 700 мнг на мл осветленного лизата. Растворяйте в осветленном лизате кристаллический хлористый цезий до тех пор, пока его коэффициент преломления не достигнет 1.38. (Для этого на каждый миллилитр осветленного лизата требуется 0,59 г CsCl,
2. Приготовьте раствор CsCl в дистиллированной воде с коэффициентом преломления I.4I (на I мл н20 требуется 1,58 г CsCl).
3. Ультрацентрифужные пробирки заполните наполовину раствором CsCl с коэффициентом преломления I.41. Сверху наслоите равный объем осветленного лизата (коэффициент преломления 1.38). Пробирки уравновесьте попарно добав-
выделение ДНК
8
хешем раствора СвС1 ( ->^ = 1,41), заполните до верху, если необходимо, вазелиновым маслом и запакуйте.
4. Центрифугируйте 24 часа, 45 ООО об/мин, ротор Ti 60, ti 75, 20°С.
5. В результате центрифугирования должны появиться две малиново-красные зоны. Нижняя содержит плазмидную супер-спирализованную ДНК. Эту зону откачайте через длинную иглу или стеклянный капилляр с помощью перистальтического насоса.
6. Отобранную фракциг экстрагируйте 4 раза равным объемом бутанола, избавляясь от бромистого этидия, затем разбавьте в 3 раза Н20И осадите ДНК двумя объемами этанола.
Плазмидная ДНК, выделенная в двухступенчатом прсформированном градиенте СвС1, в отличие от полученной обычным центрифугированием не содержит, как правило, заметных примесей РНК и не нуждается в дополнительной хроматографической очистке.
ГИДРОЛИЗ ДНК ЭНДОНУКЛЕАЗАМ! РЕСТРИКЦИИ
Расчет количества фермента
