Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.
Скачать (прямая ссылка):
О 50 100 150
Alul 1 3 3 2 M AG CT 50 16
Avail 3 3 2 1 и G G(A/T)CC 17 8
BaoHI 1 2 3 3 H G GATCC 5 1
Bell* 1 3 3 1 M T GATCA 7 0
Bgll 1 3 3 3 If gcch4 HGGC 22 3
Bglll 2 3 3 3 L A GATCT 6 0
Bspfil 3 3 3 3 M GG CC 50 22
Clal 3 3 3 2 M AT CGAT 12 1
EcoRI - 3 3 3 H G AATTC 5 1
EcoRII - 3 3 3 H CC(A/T)GG 35 6
Haell 3 3 3 2 L PuGCGC Py 30 11
HlncII 2 3 3 3 M GTPy PuAC 34 2
Hindlll** 2 3 3 3 M A AGCTT 6 1
Hinfl 2 3 3 3 in G АИТС 50 10
Kpnl 3 1 1 1 L GGTAC С 2 0
UspI 3 3 3 3 Ы С CGG 50 26
PstI*** 3 3 3 3 M CTGCA G 18 1
Pvul 1 2 3 3 H CGAT CG 3 1
PvuII 3 3 3 3 Ы CAG CTG 15 1
Rsal 3 3 3 3 M GT AC 50 3
SacI L GAGCT С 2 0
SalGI 1 1 2 3 H G TCGAC 2 1
Sau3A 3 3 3 3 in GATC 50 22
Slal H С TCGAG 1 0
Smal**** CCC GGG 3 0
SphI 1 1 3 3 H GCATG С 4 1
Tad***** 3 3 Э 2 L T CGA 50 7
* _ оптимум 60°C 1 - 10% активности
** - оптимум 37-55°С 2-10- 30% активности
*** - оптимум 21-37°С 3 - 30—I00S6 активности
**** _ специальный буфер
***** - оптимум 65°С
ВВЕДЕНИЕ МЕТНИ В ДНК
I, Введение концевой метки в ДНК
А. Введение метки с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4
Полинуклеотидкиназа осуществляет перенос у фосфатных групп с АТФ на он - 5'-конец ДНК (прямая реакция). В присутствии АДФ она способна осуществлять также реакцию обмена между АТФ и фосфорилированным 5' концом ДНК. Первая реакция протекает более эффективно, но требует предварительного дефосфорилирования фгагмента ДНК с помощью фосфатазы.
Дефосфорилирование фрагментов ДНК
1. Реакцию проводите в пробирке "эппендорф". Смешайте.
90 мкл 50 мМ трис-НС1 pH 8,0
10 мкл ДНК фрагмента рестрикции (I—10 мкг)
I мкл щелочной фосфатазы (0,01-0,1 е.а.)
Реакцию проводите при 37°С для фрагментов ДНК с тупыми или выступающими 5'-концами или при 65°С для фрагментов с выступающими 3'-концами. Время реакции 30 мин.
2. От фосфатазы избавьтесь, дважды экстрагируя ДНК равным объемом смеси фенола с хлороформом 1:1, насыщенной 50 мМ трис-НС1 pH 8,0.
3. Фенол из водной фазы удалите экстракцией 5-ю объемами эфира, насыщенного водой.
4. Добавьте к водной фазе 12,5 мкл 3 М NaAc pH 5,2 и 375
введение метки в ДНК
15
мкл этанола. Смесь инкубируйте при -70°С в течение 10 мин. Центрифугируйте 5 мин.
Примечание. Инкубатор на -70°С можно приготовить в термосе с широким горлом, залив в него 66% этанол и охладив до -70°С жидким азотом.
5. К осадку прибавьте 500 мкл этанола и сразу же, не ре-суспендируя осадок, центрифугируйте I мин. Осадок подсушите под вакуумом.
Введение метки с помощью полинуклеотидкиназы на 5' конец дефосфорилированной ДНК
Реакция для фрагментов с выступающими 5' концами
I. Смешайте в пробирке "эппендорф"
5 мкл (1-50 пмоль) дефосфорилированного фрагмента ДНК 40 мкл бидистилированной воды 5 мкл 500 мМ трис-НС1 pH 7,5, 100 мМ Mgd2, 50 мМ
досуха
I мкл полинуклеотидкиназы Т4 (20 ед. акт.)
2. Реакцию проводите при 37°С в течение 30 мин.
Реакция для фрагментов с 3' выступающими или тупыми концами
I. Смешайте в пробирке "эппендорф"
5 мкл дефосфорилированной ДНК (1-50 пмоль)
35 мкл 20 мМ трие-HCl pH 9,5, I «й! спермидин, 0,1 мМ ЭДТА.
введение метки в ДНК
16
2. Прогрейте смесь при 90°С в течение 2 мин, быстро охладите во льду и перенесите в пробирку, содержащую:
5 мкл буфера 500 мМ трис-НС1 pH 9,5, 100 мМ MgCl2,
50 ДТТ, 5056 (об/об) глицерина 50 мкл н20
50 мкКи ( у -32Р) АТФ 1000 Ки/ммоль, упаренных досуха
I мкл полинуклеотидкиназы Т4 (20 ед.)
3. Реакцию проводите при 37°С в течение 15 мин.
Введение метки с помощью полинуклеотидкиназы Т4 на 5' конец фосфорилированной ДНК. Реакция обмена.
1. Смешайте
5 мкл ДНК с 5’-концевым фосфатом (1-50 пмоль)
36 мкл HgO
5 мкл 500 мМ имидазол-НС1 pH 6,6, 100 мМ MgCl2,
50 мН ДТТ, I мМ спермидин, I мМ ЭДТА
3 мкл 5 мМ АДФ
100 мкКи ( у -32Р) АТФ 1000 Ки/ммоль, упаренных досуха
I мкл полинуклеотидкиназы Т4 (20 ед.)
2. Реакцию проводите при 37°С в течение 30 мин.
После окончания реакции фосфорилирования от избытка ^-АТО избавьтесь гель-фильтрацией на G-50, р-6 или подвергая продукты реакции гель-электрофорезу.
