Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Схема приема
Начальная культура
I
Проверка на загрязнения Провная заморозка
Проверка видовой принадлежности “
Проверка на загрязнения Запас клеток для Культуры исходному
Проверка видовой принадлежности ^посева и начальный поставщику для Изоэнзимология Жзапас для ^ идентификации
Кариология V нсипяределе‘ ^
Эффективность клонирования % Рекомендации
Функциональные тесты Ъ Консультативному Совету
Тесты на опухолеродность ^ Для выдачи сертификзга
Контроль тонкой струнтуры Пополнение яяпяг-а
Иммунологичесние тесты для распределения
Рис. 4.1. Схема, иллюстрирующая рекомендуемый плаи приема клеточных линий в банк для общего распределения. Определение по крайней мере двух характеристик, приведенных с левой стороны схемы, должно проводиться перед выходом из лаборатории любой линии клеток.
отбором клеточных линий, старением и трансформацией, можно решить, если строго придерживаться этого принципа.
Работы со всеми первичными культурами и линиями клеток, для которых не показано специфическими методами отсутствие примесных биологически вредных агентов, следует проводить в ламинарном боксе II класса (BS5726; NIH Spec. 03-112). Эта предосторожность защитит персонал, работающий с культурами клеток, и лабораторию от инфекции и загрязнений. Более того, есть рекомендации о соблюдении подобных предосторожностей при работе с линиями опухолевых клеток человека из-за присутствия в клетках онкогенов и показанной недавно возможности трансфекции, по крайней мере в системе клеточные культур. ,
3. Замораживание клеток и оценка выхода
Повреждения клеток, происходящие при замораживании и оттаивании культуры, обусловлены, по-видимому, внутриклеточными кристаллами льда и осмотическими эффектами. До-
бавление криопротекторов, таких как диметилсульфоксид {ДМСО) и глицерин, а также прибор оптимальных скоростей замораживания и оттаивания сводят повреждения клеток к минимуму.
Возможно кратковременное сохранение замороженных клеток в шкафу глубокого охлаждения (—75 °С), но значительно лучше хранить клетки в жидком азоте (—196 °С) либо в его парах (—120 °С). Метод замораживания в жидком азоте предпочтительнее не только из-за более низкой температуры и, следовательно, почти неограниченного срока хранения, но и вследствие полного отсутствия риска механического повреждения клеток. Хранение ампул в жидком азоте со всей очевидностью необходимо при создании любых банков клеток, за исключением самых маленьких.
Специально остановимся на двух проблемах техники безопасности при работе с клеточными линиями. Во-первых, подвергаются опасности сотрудники, размораживающие ампулы; жидкий азот может проникать в ампулы через микротрещины, образованные при хранении. При размораживании быстрое испарение азота внутри ампулы может приводить к ее взрыву и разлетанию стекол. К счастью, частота таких случаев резко снижается по мере того, как оператор накапливает опыт запаивания и проверки ампул (разд. 3.1.1 и 3.3). Однако даже при самой высокой квалификации обслуживающего персонала опасность взрыва остается. Поэтому извлечение ампул из азота должно проводится в защитной маске.
Во-вторых, ДМСО может растворять органические вещества и благодаря проникновению через резину и кожу переносить их в кровь. Поэтому при работе с ДМСО следует соблюдать особые меры предосторожности, чтобы избежать попадания в ДМСО вредных химических соединений и свести до минимума его контакт с кожей.
3.1. Оборудование
3.1.1. Ампулы, маркировка и устройство дпя запаивания
Вопрос об использовании стеклянных или пластиковых ампул следует решать исходя из масштабов заморозки и предназначения замораживаемых клеток. Стерильные стеклянные ампулы заполняют суспензией клеток и прочно запаивают в относительно больших количествах. Такие ампулы рекомендуются для больших партий клеток, предназначенных для длительного использования или дальнейшего распределения. Меньшее количество пластмассовых ампул, более удобных в обращении, чем стеклянные, проще маркировать и закрывать. В некоторых случаях могут возникнуть проблемы с запаиванием, особенно в
случаях необходимости частой сортировки материала или подготовки его для отправки в другие организации.
Маркировка ампул требует специального рассмотрения, поскольку четкость надписей может прояздать в ходе замораживания ампул, открывания и закрывания бокса с ампулами, их переноса между холодильниками или контейнерами для перевозки и т. д. Использование бумажных ярлыков, шариковых
Рис. 4.2. Устройство для запаивания стеклянных ампул. Ампулы перемещаются справа налево и автоматически поворачиваются, при этом кончик каждой ампулы нагревается в пламени. При максимальной температуре кончик оттягивается кверху и размягченное стекло запаивается (см. слева). Для правильного запаивания необходимо соблюдать определенную скорость перемещения рукоятки.
