Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
4.1.2. Адаптацня
В основе этого метода лежат те же принципы, что и при получении суспензионной культуры отбором. Однако в случае адаптации отбор направлен на клетки, находящиеся в суспензии благодаря механическому перемешиванию. Поскольку из большинства клеточных линий получается слишком большое число клеток, независимых от субстрата, вряд ли можно объяснить их появление только селекцией предсуществующих вариантов. Метод, описанный ниже и успешно примененный автором для многих клеточных линий, основан на исследованиях Кэп-стика с сотрудниками [19], проведенных на клетках ВНК21.
I. Приготовьте суспензию клеток, обрабатывая монослой трипсином (0,1%) и версеном (0,01%).
II. Подготовьте не менее двух, а лучше три или более сосуда-с мешалкой, содержащих культуральную среду (любая известная среда, из которой удалены Са2+ и Mg2+).
III. Добавьте клетки до концентрации не менее 5-105 клеток/' /мл и инкубируйте при перемешивании (минимальная воз-
можная скорость, поддерживающая суспензию в гомогенном состоянии, например 250 об/мин).
IV. Отбирайте пробы и подсчитывайте число жизнеспособных клеток каждые 24 ч.
V. Каждые 3 дня осаждайте клетки центрифугированием (800 об/мин) и суспендируйте в свежей среде до плотности не менее 2,5-105 клеток/мл. В зависимости от степени гибели клеток у вас почти наверняка будет возникать необходимость объединения нескольких культур для поддержания плотности клеток на требуемом уровне.
VI. Если при смепе среды обнаруживается значительное прикрепление клеток к поверхности культурального сосуда, особенно на границе среды и воздуха, добавьте в сосуд после удаления среды смесь трипсина (0,01%) и версена (0,01%) и инкубируйте при перемешивании в течение 30 мин при 37 °С. Открепившиеся клетки соберите центрифугированием. Если в суспензии появляются агрегаты клеток, их также можно обработать смесью трипсина и версена. Такая обработка обычно необходима при первой и второй сменах среды, но в дальнейшем необходимость в ней, как правило, отпадает. Если агрегация клеток сохраняется, добавьте в ростовую среду трипсин (50 мкг/мл) или диспазу (Boehringer).
VII. Успешная адаптация обнаруживается вначале по увеличению количества клеток после смены среды, а далее по постоянному росту клеточной массы в течение данного периода времени, свидетельствующему о постоянной скорости роста.
VIII. Обычно оказывается необходимым культивировать вновь полученную линию клеток при постоянном перемешивании, поскольку в статической суспензионной культуре возможна реверсия к зависимости от субстрата. Иногда клетки прикрепляются к поверхности без последующего распластывания и продолжают расти и делиться, сохраняя почти сферическую морфологию.
4.2. Статические суспензионные культуры
Многие линии клеток могут расти в суспензии в культуральных системах, используемых для культивирования клеток в монослое (т. е. без встряхивания или перемешивания). К числу клеточных линий, способных к такой форме роста, относятся многие линии лимфобластов (например, MOLT, RAJI), гибри-домы и некоторые некроветворные клетки, такие как клетки LS, описанные в предыдущем разделе. Однако в последнем случае всегда существует опасность реверсии к монослою (небольшая часть линии клеток LS всегда прикрепляется к стенкам сосуда
и теряется при каждом пересеве). Статические суспензионные культуры клеток непригодны для увеличения масштабов культивирования по причинам, уже названным при рассмотрении монослойных культур.
4.3. Небольшие суспензионные культуры
Для удобства изложения небольшие суспензионные культуры в этой главе будут определяться так же, как и в разд. 2.1. Это чисто условное определение, основанное на том, что увеличение объема культуры выше 2 л требует введения в систему дополнительных факторов. Культивирование клеточной суспензии в лабораторных условиях осуществляется обычно во вращательных сосудах, названных так потому, что они содержат в качестве перемешивающего элемента магнитный стержень, приводимый в движение внешней магнитной мешалкой. Детали некоторых широко доступных вращательных сосудов, а также названия фирм-поставщиков и размеры приведены на рис. 3.12. Важно иметь магнитную мешалку высокого качества, чтобы создавалось достаточно сильное магнитное поле, плавно поворачивающее магнит в желаемом диапазоне скоростей вращения (50—500 об/мин), безотказно работающую в течение долгого времени. Кроме того, магнитная мешалка не должна слишком нагреваться, поскольку культуральный сосуд устанавливается прямо на ее верхушку, и желательно включать в систему тахометр, обеспечивающий регистрацию истинной скорости вращения. Всегда проверяйте, может ли мешалка запускаться из всех возможных положений после перерыва в энергоснабжении.
4.4, Факторы, определяющие процесс наращивания клеток
Увеличение масштаба культивирования возможно лишь при удовлетворении всех химических и физических потребностей клеток. Химические факторы требуют постоянной проверки окружающей среды и контроля содержания клеток в определенных физиологических условиях. Эти факторы, к числу которых относятся кислород, pH, компоненты среды, а также процесс удаления продуктов отходов, описаны в разд. 2.
