Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
I. Объедините содержимое размороженных ампул (примерно 5% от всей партии) и проведите серийное разбавление культуры для получения суспензий 102—104 «леток/культура в зависимости от линии клеток, размера культуральной поверхности и ожидаемого результата. Так, клетки с высокой эффективностью клонирования следует высевать на чашки диаметром 9 см по 10 клеток, 100 клеток, 1000 клеток и 10 000 клеток.
II. Проведите серийное 10-кратное разбавление клеток на каждом этапе путем переноса 1 мл суспензии в 9 мл полной ростовой среды. Полулогарифмическое разведение осуществляется путем переноса 1 мл суспензии в 2,16 мл культуральной среды. Для перемешивания клеток и следующего этапа разведения на каждом этапе серийного разведения используйте новую стерильную пипетку того же объема.
III. По 1 мл полученных разведений, начиная с самых низких концентраций, разлейте в каждый из трех сосудов Т-75 (или других подходящих культуральных сосудов), содержащих по 8 мл культуральной среды, и инкубируйте при 37 °С.
IV. Смените среду в полученных культурах на четвертый или пятый день и далее меняйте среду каждый третий или четвертый день.
V. После 12—14 сут культивирования слейте среду и зафиксируйте клетки 10%-ным раствором формальдегида или другим фиксатором.
VI. Удалите фиксатор, осторожно ополосните клетки несколькими сменами водопроводной воды и окрасьте 1%-ным водным раствором толуидинового синего или другим простым красителем в течение 1—5 мин.
VII. Удалите краситель, смойте оставшийся раствор водопроводной водой, с помощью препаровальной лупы подсчитайте клоны, содержащие 16 и более клеток.
VIII. Подсчитайте эффективность клонирования по формуле: число клонов/число посеянных клетокХЮ0%.
3.3.3. Пролиферация в массовой культуре
Жизнеспособность размороженных клеток, как зависимых от субстрата, так и растущих в суспензии, можно также оценивать по их пролиферации в течение первых 1—2 нед после размораживания. Рекомендуется следующая процедура:
I. Суспензию клеток (5% всей партии замороженных ампул) рассейте с различной плотностью в одинаковые культуральные сосуды (например, флаконы Т-25). В одни флаконы, например, посадите столько клеток, чтобы через 7 сут культура достигла полного монослоя или максимальной плотности. В другие флаконы — вдвое большее количество клеток, а в третьи — в 3—5 раз больше клеток, чем в первые (в зависимости от числа жизнеспособных клеток).
II. Через 4 сут смените среду (или добавьте свежей среды, если клетки растут в суспензии).
III. Соберите клетки из всех трех наборов культур стандартной трипсинизадией, если клетки прикреплены к субстрату, или отберите определенную часть суспензионной культуры и подсчитайте число клеток с помощью гемоцито-метра или электронного счетчика клеток.
IV. Определите степень увеличения количества клеток (отношение числа полученных клеток к числу посеянных) и сравните полученные результаты с теоретически рассчитанными результатами для клеток на логарифмической или предконфлюентной фазах роста.
Типичные результаты всех тестов, приведенных выше для большого количества клеточных линий, можно найти в каталоге линий II АТСС [8].
4. Определение качества клеточных линий
Помимо оценки выхода клеток после замораживания жидким азотом необходима проверка клеток и по другим параметрам, включая подтверждение вида и доказательство отсутствия загрязнения грибами, бактериями и микоплазмой.
4.1. Контроль
Тип клеток, от которого ведет начало линия, может быть подтвержден рядом иммунологических тестов, анализом изофер-ментного состава и/или цитогенетическими методами [10]. Преимущества и проблемы, связанные с использованием каждого из этих методов, будут рассмотрены в соответствующих разделах.
4.1.1. Окрашиввние флуоресцентными внтителами
Метод непрямой окраски флуоресцентными антителами используется в АТСС в качестве одного из способов подтверждения вида линии клеток. Техника окрашивания включает два этапа. На первом из них из сыворотки кролика получают ви-
доспецифические антитела, которыми окрашивают исследуемые клетки (табл. 4.1). Параллельно окрашивают клетки, заведомо окрашивающиеся (положительный контроль) или неокрашива-ющиеся (отрицательный контроль) этими антителами. На втором этапе клетки обрабатывают анти-кроличьими антителами козы, связанными с флуоресцентным красителем изотиоциана-том флуоресцеина (ФИТЦ). Вторые антитела связываются с
Таблица 4.1. Получение антисывороток к культивируемым клеткам
1. Соберите клетки с поверхности культуральной посуды с помощью раб-бера.
2. Трижды промойте клетки суспендированием их в растворе Хэнкса11 и центрифугированием при 200 g в течение 10 мин.
3. Ресуспендируйте в растворе Хэнкса до конечной концентрации 5 * 10s клеток/мл (первая неделя), 106 клеток/мл (вторая неделя) и 107 клеток/мл (третья неделя).
4. Введите по 1 мл суспензии в каждую краевую ушную вену здоровых кроликов дважды в неделю в течение 3 нед, увеличивая каждую неделю дозу клеток, как указано в п. 3.
