Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
4.8. Инкапсулированные клетки
Заключение клеток в полутвердый матрикс или сферы бывает необходимо во многих случаях, но главной целью всегда остаются стабилизация клеток и защита их от субоптимальных условий. Клетки могут быть иммобилизованы путем адсорбции, с помощью ковалентного связывания, образования поперечных сшивок или путем «запутывания» в полимерном матриксе. Для иммобилизации можно использовать желатин, полилизин, альгинат или агарозу; выбор материала зависит главным образом от решаемой задачи. Эта техника получила распространение для защиты клеток при транспортировке или почтовом обмене между лабораториями, для хранения клеток при 4 °С в течение длительного периода (5нед), для предотвращения иммунного отторжения трансплантированных клеток, для защиты хрупких клеток (например, клеток гибридом) от механического стресса
в установках для крупномасштабного культивирования [23, 24]. Последнее не только позволяет использовать такое оборудование, но и обеспечивает производство гормонов, антител, имму-нохимических агентов и ферментов в течение значительно более долгого периода, чем это возможно в гомогенной суспензионной культуре. Матрикс не препятствует свободной диффузии пи-
Рис. 3.14. Принцип ферментёра с эрлифтом.
тательных веществ и образующихся продуктов между окружающей средой и микроокружением иммобилизованных клеток.
Альгинат представляет собой полисахарид, поперечно сшиваемый ионами Ca2f. Скорость образования поперечных сшивок зависит от концентрации Са2+ (так, в присутствии 10 мМ СаС12 для образования сшивок требуется ~30 мин). Рекомендуется следующая методика заключения клеток в альгинат. Клетки суспендировать в изотоническом растворе NaCl, забуференном трисом (1 мМ) и содержащим 4%-ный альгинат натрия. Полученную суспензию добавлять по каплям в перемешиваемый раствор, содержащий изотонический раствор, 1 мМ трис-буфер pH 7,4 и 10 мМ СаС12. Образующиеся частицы имеют диаметр 2—
3 мм. Заключенные в частицы клетки можно высвободить, растворяя полимер 0,1 М ЭДТА или 35 мМ цитратом натрия. Не-
достатком альгината является необходимость присутствия 'Са2+ и отсутствия фосфата, а также то, что крупные молекулы, такие как моноклональные антитела, не могут диффундировать сквозь матрикс. Наиболее подходящей альтернативой альгинату, лишенной вышеуказанных недостатков, оказывается суспензия агарозы в парафиновом масле. Для ее приготовления агарозу необходимо растворить в лишенном Mg2+ и Са2+ ФСБ до концентрации 5% при 70 °С, охладить раствор до 40 °С и смешать с клетками, суспендированными в привычиой для них ростовой среде. Полученную смесь смешать с равным объемом парафинового масла и эмульсифицировать на Вибро-миксере. Полученную эмульсию охладить в ледяной бане, добавить ростовой среды и центрифугированием удалить масло. Частицы (80— 200 мкм) промыть средой, центрифугировать и после удаления остаточного масла перенести в культуральный сосуд.
Использование заключенных в полимерный матрикс клеток в ферментёрных культурах представляется заманчивой техникой получения клеточных продуктов. Во многих случаях в этом методе могут быть использованы преимущества культуры с микроносителями (гранулы с растущими на их поверхности клетками) в смене среды и в соотношении объемов клеток и среды. Кроме того, заключение клеток в матрикс может быть использовано для облегчения перфузии или смены среды, и продукты можно будет получать свободными от клеток.
Литература
1. Griffiths J. В. (1972). J. Cell Sci., 10, 512.
2. Good N. Е. (1966). Biochemistry, 5, 467.
3. Leibovitz A. (1963). Am. J. Hyg., 78, 173.
4. Spier R. EGriffiths J. B. (1984). Dev. Biol. Stand., 55, 81.
5. Toth G. M. (1977). In: Cell Culture and its Applications, Acton R. Т.,
Lynn J. D. (eds ), Academic Press, NY, p. 617.
6. Griffiths J. B. (1984), Dev. Biol. Stand., 55, 113.
7. Maroudas N. G. (1975). J. Theor. Biol., 49, 417.
8. Kruse P. J., Keen L. N., Whittle W. L. (1970). In Vitro, 6, 75.
9. Corbiel М., Trudel М., Payment P. (1979). J. Clin. Microbiol., 10, 91.
10. Skoda R.j Pakos V., Hermann A., Spath O., Johansson A. (1979). Dev. Biol. Stand., 42, 121.
11. Munder P. G„ Modolell M„ Wallach D. F. H. (1971). FEBS Lett, 15, 191.
12. Jensen M. D. (1981). Biotech. Bioeng., 23, 2703.
13. Burbidge C., Darcey I. К (1984). Dev. Biol. Stand., 55, 255.
14. Whiteside J. P., Spier R. E. (1981). Biotech. Bioeng., 23, 551.
15. Weiss R. E., Schleiter J. B. (1968). Biotech. Bioeng., 10, 601.
16. van Wezel A. L. (1967). Nature, 216, 64.
17. Griffiths J. B., Thornton B. (1982). J. Chem. Technol. Biotechnol., 32, 324.
18. Spier R. E., Whiteside J. P. (1984). Dev. Biol. Stand., 55, 151.
19. Capstick P. B., Garland A. J., Masters R. C., Chapman W. G. (1966). Exp Cell Res., 44, 119.
20. Feder J., Tolbert W. R. (1983). Sci. Am., 248, 24.
21. Tovey M. G. (1980). Adv. Cancer Res., 33, 1.
22. Pirt S. J., Callow D. S. (1964). Exp. Cell Res., 33, 413.
