Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
5. Проведите трн или более подхлеста, вводя в каждое ухо по 1 мл суспензии клеток в концентрации 107 клеток/мл еженедельно.
6. После третьего подхлеста соберите сыворотку и сделайте серийные разведения. Смешайте разведения антисыворотки с равным объемом суспензии клеток (106 клеток/мл) и оцените жизнеспособность клеток, пользуясь описанным ранее методом исключения красителя.
7. Еслн титр антисыворотки удовлетворителен (1:8 или более), соберите кровь пункцией сердца, дайте образоваться сгустку в течение 1—2 ч при комнатной температуре и центрифугируйте 15 мин при 200 g.
•8. Удалите сыворотку, инактивируйте комплемент нагреванием при 56 °С в течение 30 мин, проведите соответствующее разведение и разделите на порции по 0,2 мл для хранения при —70 °С.
’) Все растворы готовятся на бидистиллированной воде (БВ), перегнанной в стеклянной посуде, за исключением случаев, указанных особо. Для более подробного ознакомления см. [10].
антителами кролика, уже прикрепившимися к исследуемым клеткам. Полученные комплексы антиген — антитело выявляются в люминесцентном микроскопе по флуоресценции антител, связанных с ФИТЦ.
Для подтверждения вида проверяемой линии клеток рекомендуется следующая процедура:
I. Клетки трипсинизируйте, если это необходимо, и трижды промойте, суспендируя их в ФСБ, pH 7,5, и центрифугируя для получения осадка.
II. Ресуспендируйте промытые клетки в ФСБ до конечной плотности 3—4-10® клеток/мл.
III. Смешайте 0,1 мл клеточной суспензии с 0,1 мл разбавленной антисыворотки и поместите во влажную инкубационную камеру при комнатной температуре на 30 мин. Нужное разведение антисыворотки подбирается эмпириче-
ски для каждого препарата антисыворотки с использованием клеток положительного контроля. Неспецифическая адсорбция преодолевается обычно дополнительным разведением сыворотки.
IV. Обработанные клетки промойте для удаления неадсорби-рованной сыворотки трехразовым переосаждением в ФСБ и затем инкубируйте 30 мин в темноте с 0,1 мл конъюгированных с ФИТЦ ан-тикроличьих антител козы (коммерческий препарат).
После трех конечных дополнительных циклов промывания ФСБ каплю суспензии промытых клеток заключите под покровное стекло. Препарат изучается во флуоресцентном микроскопе при увеличении 500X с использованием возбуждающего фильтра BG 12 и запирающего фильтра № 50 (микроскоп Zeiss Universal с эпиосвещением) .
VI. Положительная реакция выявляется в виде зеленой флуоресценции по периферии клеток (рис. 4.3).
VII. В каждом тесте помимо исследуемых клеток проверяются клетки близкородственного вида и неродственные клетки.
Этот метод представляет собой модификацию метода Стул-берга [10]. Он имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами, более прост и позволяет идентифицировать мельчайшие клеточные примеси в исследуемой популяции. Стулберг отмечал, что при определенных условиях разрешения предложенный метод позволяет выявить одну чужеродную клетку в популяции из 10 000 клеток.
4.1.2. Спектры изоферментов
Анализ изоферментов, проведенный в гомогенатах линий клеток 25’видов, показал, что этот биохимический признак можно использовать для подтверждения вида [11]. Определяя спектры трех изоферментных систем (глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (ГФД), лактатдегидрогеназы (ЛД) и нуклеозидфос-форилазы (НФ)) с помощью вертикального электрофореза в крахмальном геле, можно с высокой степенью надежности оп-
Рнс. 4.3. Непрямой флуоресцентный тест с антителами для определения вида клеток. Обратите внимание на флуоресцентный ореол вокруг клеток, показывающий типично положительную реакцию (Фотография любезно предоставлена М. Л. Мэси.)
ределить вид, от которого происходит линия клеток. Этот метод относительно прост, дает воспроизводимые результаты и не требует дорогого оборудования.
Метод получения экстрактов клеток приведен в сжатой форме в табл. 4.2. Состав исходных буферов для электрофореза в крахмальном геле приведен в табл. 4.3. Компоненты для электрофоретического разделения и выявления в геле трех ферментов представлены в табл. 4.4.
Рекомендуется следующий порядок приготовления крахмального геля:
I. Суспендируйте 60 г крахмала для электрофореза в 500мл соответствующего буфера и получите однородную суспензию путем перемешивания при нагревании до 90 °С. Это-
Таблица 4.2. Получение клеточных экстрактов
1. Получите клеточную суспензию стандартными методами и трижды промойте клетки переосаждением в 0,9%-ном растворе NaCl (pH 7.1), содержащем 6,6 -10—4 М ЭДТА
2. Ресуспендируйте промытые клетки в солевом растворе с ЭДТА до концентрации 2—5-107 клеток/мл
3. Разрушьте клетки тремя циклами замораживания и оттаивания в жидком азоте или в смеси сухого льда с этанолом. Можно также разрушить клетки ультразвуком или смешиванием с равным объемом октилового спирта (при 4 °С в течение ночи)
4. Разлейте гомогенат по пробиркам Эппендорфа, осветлите центрифугированием на микроцентрифуге в течение 1—2 мин и храните при —70 "С для последующего анализа
