Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Перенос массы между фазами культуры уже обсуждался в связи с проблемой обеспечения кислородом (см. разд. 2.7). Именно эта характеристика увеличения масштаба требует сверхизощренности при создании культуральных систем для поддержания физиологической адекватности окружающей среды. Под изощренностью в данном случае мы понимаем и специальные конструкции роторов, и подбор систем снабжения кислородом, и выбор формы сосуда, и создание перфузионных контуров, а также развитие совершенно иных концепций создания культур, не использующих реактор с перемешиванием.
4.5. Ферментёры с перемешиванием
Переход от вращательных сосудов с внешним магнитным приводом к ферментёрам, способным увеличивать объем культур от 1 до 1000 л и выше, приводит к следующим модификациям:
а) Переход от стеклянных сосудов к сосудам из нержавеющей стали.
б) Переход от переносных систем к стационарным, подсоединение к горячему пару для стерилизации in situ, потребность в водяной рубашке или внешнем температурном контроле, необходимость во вспомогательных сосудах для посева клеток, для поддержания среды и системы слива культуры.
б) Большая сложность систем контроля среды в связи с уве-
личивающимися требованиями к переносу массы.
На практике максимальный размер вращающих сосудов не превышает 20 л. Выше этого значения создаются сложности, с передвижениями и автоклавированием элементов системы, а также трудности в адекватном перемешивании систем. В продаже имеются ферментёры с мешалками с приводом от двигателя, начиная с объема 500 мл, но эти установки используются главным образом для выращивания бактерий. Очень важным этапом является переход к системам объемом выше 10—20 л, поскольку возрастает стоимость оборудования (иапример, полная система на 35 л стоит 15 000—20 000 фунтов стерлингов) и появляется потребность в специальных лабораторных приспособлениях (источник горячего пара, водопровод и т. д.). Известей большой набор сосудов, поставляемых фирмами — изготовителями ферментёров, но эти сосуды большей частью разработаны для выращивания бактерий и не идеальны для большинства клеток животных. Однако в последнее время в продажу стали поступать ферментёры, более пригодные для животных клеток, и эти системы включают в себя следующие модификации:
1) подходящую мешалку (например, морской винт);
2) отсутствие разделяющих перегородок;
3) выгнутое дно для лучшего перемешивания при низкой скорости;
4) водяную рубашку вместо нагревательной системы температурного контроля погружного типа (для избежания локальных перегревов при низкой скорости вращения);
5) мешалку с приводом сверху, чтобы клетки не захватывались участками между движущимися частями.
Пока перемешивание аккуратно и, следовательно, перенос кислорода в сосудах осуществляется без повреждения клеток, отсутствуют и ограничения в увеличении масштаба культуры. Клетки ВНК21 выращивались в ферментёре объемом 2000 л для получения вакцинного вируса ящура. В таких же системах могут выращиваться многие гетероплоидные линии клеток, иапример Vero и HeLa. Однако, поскольку контролирующие органы требуют, чтобы фармацевтические продукты получали главным образом из нормальных диплоидных клеток (которые не растут в суспензии), единственным способом стимулировать крупномасштабное культивирование является получение препаратов для ветеринарии. Тем не менее существует много областей применения всевозможных продуктов, полученных из разных типов клеток, и для получения этих продуктов используются системы объемом 2—50 л. В настоящий момент важным стимулом развития крупномасштабных культуральных систем стало выращивание клеток гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. В культурах клеток выход антител оказывается в 50—100 раз ниже, чем в клетках, пассируемых в
брюшной полости мышей. К настоящему времени потребность в моноклональных антителах ограничивается задачами диагностики и аффинной хроматографии. В дальнейшем несомненно возникнет потребность в этих антителах для терапевтических и профилактических целей. Многие из этих клеток очень хрупки и дают в культурах низкий выход, так что специализированная техника и аппараты, описанные в разд. 4.7, частично предназначены именно для этого типа клеток.
4.6. Проточные культуры
4.6.1. Введение
При субмаксимальных скоростях рост клеток определяется концентрацией одного рост-лимитирующего питательного вещества. Это положение лежит в основе создания хемостата — культуры с фиксированным объемом, в которую с постоянной скоростью поступает среда, смешивается там с клетками и с такой же скоростью оттекает. Рост клеток начинается в непроточной культуре, где инокулят дорастает до максимальной плотности, которая может быть обеспечена рост-лимитирующим фактором (предполагая, что скорость разведения ниже максимальной скорости роста). По мере снижения концентрации рост-ограничивающего питательного фактора снижается и скорость роста клеток, пока она не станет равной скорости разведения суспензии. Когда это происходит, говорят, что культура достигла «равновесного» состояния, поскольку и число клеток, и концентрация питательных веществ далее остаются постоянными.
