Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конки Д. -> "Культура животных клеток" -> 47

Культура животных клеток - Конки Д.

Конки Д., Эрба Э., Френши Р., Гриффитс Б. Культура животных клеток — М.: Мир, 1989. — 333 c.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка): kulturajivotnihkletok1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 136 >> Следующая

VI. Запаяйте каждую ампулу, поместите их в специальный держатель или на какой-либо лоток и полностью погрузите в водный раствор метиленовой синьки (0,05%) при
4 °С. Через 30—45 мин извлеките ампулы, промойте холодной водопроводной водой и выбросьте ампулы, в которые проник краситель.
VII. Тщательно высушите ампулы и начните медленное замораживание. Оптимальная скорость замораживания составляет обычно 1°/мин, но может быть иной в зависимости от вида клеток, так что перед замораживанием большого количества клеток ее лучше подобрать эмпирически.
VIII. Когда температура ампул достигнет (—50) — (—70) °С и ниже, извлеките их из охлаждающего устройства и быстро перенесите в рефрижератор с жидким азотом.
IX. Отметьте место хранения ампул и тип содержащихся в них клеток. Для этой цели следует использовать две раздельные картотеки, составленные по природе хранящихся клеток и по положению сохраняемых ампул в рефрижераторах.
3.3. Размораживание и оценка выхода клеток
Для оптимального восстановления жизнеспособности клеток
необходима высокая скорость их размораживания.
I. Надев маску, защищающую лицо и шею, извлеките нужные ампулы и быстро поместите их в теплую водяную баню (37°С). Если ампулы хранились в жидком азоте (а не в его парах), каждую ампулу надо размораживать независимо, помещая ее под слой воды толщиной около 10 см при 37 °С в цилиндр объемом 1,5—2 л с плотно закрывающейся крышкой.
II. Встряхивайте ампулу с содержимым 20—60 с, пока суспензия полностью не растает.
III. Погрузите ампулу в 70%-ный этанол при комнатной температуре.
IV. Надпилите ампулы небольшой пилочкой, предварительно обработанной этанолом. В случае предварительно надпиленных ампул такая обработка не требуется.
V. Используйте стерильное полотенце для вскрытия ампулы. Резко отломайте шейку ампулы по месту надпила.
VI. Перенесите содержимое ампулы в центрифужную пробирку или культуральный сосуд стерильной пастеровской пипеткой или шприцем. Добавьте 10 мл полной ростовой среды. В ряде случаев на этом этапе лучше добавлять среду постепенно, в течение 1—2 мин
VII. Центрифугируйте 10 мин при 200 g. К осадку добавьте свежую среду и перемешайте суспензию. В некоторых случаях центрифугирование может быть опущено, поскольку остаточная концентрация криопротектора мала; при центрифугировании же клетки могут значительно повреждаться.
VIII. Начните стандартное культивирование клеток. Если этап центрифугирования был опущен, смените среду через 24 ч.
Для оценки выхода клеток после замораживания можно использовать много методов. Естественно, что это лишь первый этап оценки качества клетск, предпринимаемый после хранения.
3.3.1. Исключение красителя для определения жизнеспособности кпеток
Весьма приблизительная оценка жизнеспособности клеток в суспензии может быть получена с помощью теста на исключение красителя. & суспензию клеток добавляется водный раствор красителя, и на гемоцитометре (камера Горяева) подсчитывается относительное количество неокрашиваемых клеток. Для этой цели наиболее часто применяются трипановый синий или эритрозин В. Известно, что первый краситель обладает высоким сродством к растворенным белкам (например, к белкам сыворотки). Это может снизить точность оценки, если концентрация сыворотки в суспензии превышает 1%. Раствор эритрози-на В прозрачен, что позволяет легко обнаружить рост микробов в концентрированном растворе или образование осадка. При использовании концентрированного раствора трипанового синего это оказывается не так просто. Рекомендуется следующая процедура оценки жизнеспособности клеток по исключению красителя.
I. Получите однородную суспензию клеток в ростовой среде, используя любой стандартный метод. Для оценки процесса замораживания рекомендуется объединить содержимое примерно 5% всех ампул.
II. Разбавьте точно измеренный объем клеточной суспензии исходным раствором красителя. Обычно исходный раствор содержит 100 мг эритрозина В на 100 мл изотонического ФСБ, доведенного до pH 7,2—-7,4 с помощью 1 М NaOH. Для точности и легкости подсчета конечная концентрация клеток должна составлять 0,3—2-106 клеток/мл.
III. Подсчитайте относительное количество окрашенных клеток, имея в виду, что использование для подсчета большего числа клеток обеспечит более точную оценку. Подсчет ¦клеток лучше всего производить в течение 1—5 мин после смешивания суспензии клеток с красителем.
3.3.2. Эффективность клонирования
Тест на исключение красителя обычно дает завышенную оценку жизнеспособности клеток. Для линий прикрепляющихся клеток более точная оценка выживаемости может быть получена путем анализа эффективности клонирования размороженных клеток. При этом следует помнить, что на полученном результате скажутся вид ростовой среды, выбор субстрата, на кото-
ром будут клонированы клетки, продолжительность инкубации и т. д. Поэтому при сравнении различных препаратов замороженных клеток одной и той же линии следует стандартизировать условия тестирования. Ниже представлена схема анализа клонального роста клеток, рекомендуемая АТСС.
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed