Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
23. Nilsson K., Mosbach K. (1980). FEBS Lett., 118, 145.
24. Nilsson К., Scheirer W„ Merton O. W., Ostberg I.., Liehl E„ Katinger H.W. D., Mosbach K- (1983). Nature, 302, 629.
ГЛАВА 4
СОХРАНЕНИЕ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КЛЕТОК
Р. Хэй
1. Введение
К настоящему времени из тканей человека и других многоклеточных животных получены тысячи различных клеточных линий1'. Многие из них происходят из нормальных тканей и обладают определенным ограниченным потенциалом удвоения. Другие линии клеток могут размножаться неограниченно либо потому, что они возникают благодаря изменениям в первичной клеточной продукции, либо потому, что они исходно получены из опухолевых тканей. И линии клеток с ограниченным потенциалом размножения, и постоянные линии могут быть размножены для получения большого количества клеток, заморожены и затем охарактеризованы для широкого использования в научных исследованиях.
Преимущества работы с хорошо изученными линиями клеток, не зараженных микроорганизмами, представляются бесспорными. К сожалению, приходится постоянно иметь дело с трудностями, связанными с использованием клеточных линий. Многочисленные случаи, когда обмен клеточными линиями между разными лабораториями приводил к загрязнению клеток клетками других линий, изложены и проанализированы в других работах [2, 3]. Например, линии клеток человека оказались клетками обезьяны, мыши или мангусты, а другие линии клеток, предположительно обезьяны и норки, были идентифицированы как клетки крысы и собаки [2]. Проблема межвидового перекрестного загрязнения культивируемых линий клеток человека была поставлена около 20 лет назад, и этой теме посвящены детальные обзоры [4]. Потери времени и ресурсов, вытекающие из этой проблемы, поистине неисчислимы.
Бактериальные и грибковые загрязнения представляют дополнительные трудности, но в большинстве случаев они ярко проявляются и легко выявляются и, следовательно, приводят к менее серьезным последствиям, чем более незаметное заражение микоплазмой. Многими специалистами в области биологии микоплазмы в течение ряда лет было неоднократно показано
Использование терминов «линия клеток» и «штамм клеток» проводится в соответствии с рекомендациями комитета Ассоциации Культуры Ткани [1].
[5, 6], что присутствие этих микроорганизмов в культивируемых клетках практически сводит на нет многие результаты научных исследований, проведенных с этими линиями клеток. Тем не менее сложность выявления этих микроорганизмов и преобладание зараженных культур среди объектов исследований показывают, что важность этой проблемы невозможно переоценить.
В этой главе будет приведено описание процедур сохранения и получения характеристик клеточных линий и гибридом Американской коллекции типовых культур (АТСС). Изложенные в главе материалы основаны на результатах исследований последних 20 лет, когда стали ясны сложности, связанные с микробным, а также перекрестным загрязнением клеток, и увеличилась потребность в хорошо охарактеризованных линиях клеток.
2. Создание банка линий клеток
Линии клеток, представляющие интерес, отбираются учеными и консультантами АТСС по результатам постоянного анализа литературы. Создатели новых линий часто сами предлагают эти линии для рассмотрения. В ряде работ изложена детальная информация, касающаяся специфических групп приобретаемых клеток [7—9]. В общем случае начальные культуры или ампулы получают от донора и размножают в соответствии с инструкциями для получения первого «пробного» замораживания. Культуры, полученные из пробного материала, подвергаются тщательному изучению по изложенным ниже методикам. Если по материалам испытаний клетки заслуживают внимания, то их дополнительно размножают для получения запаса для рассева и запаса для распределения. Особо отметим, что основные результаты анализа свойств клеток получены на популяции начального запаса ампул. Запас для распределения состоит из ампул, предназначенных для рассылки по просьбе исследователей. Эталонный запас для рассева, с другой стороны, сохраняется для распределения по мере истощения первичного запаса.
Такая процедура разработана для удовлетворения потребностей большого центрального банка клеток. Она, однако, применима и в небольших лабораториях. Даже когда количество клеток линий и использующих эти линии исследователей невелико, важно отделить «посевной запас» от «рабочего запаса» или «запаса для распределения». В противном случае частые замены культивируемого материала, рекомендуемые для предотвращения сдвига фенотипа или старения, могут привести к истощению ценного посевного запаса, который трудно или дорого восстановить.
Эти различные этапы создания банка клеточных линий суммированы па рис. 4.1. Важно уяснить себе, что охарактеризованный запас для рассева служит замороженным «резервуаром» для пополнения запаса при распределении в течение многих лет. Поскольку ампулы посевного запаса используются для получения материала для распределения, получатель может быть уверен, что все полученные культуры соответствуют таковым, полученным 2, 5, 10 и более лет назад. Это наиболее критический момент в создании процедуры для получения банка клеток. Проблемы, связанные с генетической нестабильностью,
