Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Зимограммы, представленные на рис. 4.4, иллюстрируют типичную картину разделения изоферментов в обычно используемых линиях клеток от различных видов млекопитающих. Для более подробной информации обратитесь к обзору [11].
4.1.3. Цитогенетика
Кариологическая техника давно уже получила признание в качестве информативного теста на загрязнение линий клеток клетками других видов. Во многих случаях хромосомные наборы так резко различаются, что достаточно даже беглого микроскопического наблюдения. В других случаях, как, например, при сравнении линий клеток близкородственных приматов, требуется тщательный анализ хромосом, дифференциально окрашенных на G-сегменты ([Ю]; см. также разд. 4.3.3).
Таблица 4.5. Концентрированные растворы для обычного кариологического анализа
Колцемид—1 мг на 50 мл БВ; хранить замороженным в небольших ампулах КС1 — 0,075 М в БВ
Фиксатор — 3 части безводного метанола
1 часть ледяной уксусной кислоты (объединять перед использованием)
Краситель ацетоорцеин-—2 г орцеина растворяются в 100 мл 45%-ной
уксусной кислоты
Краситель Гимза—10%-ный раствор в 0,01 М фосфатном буфере pH 7 (коммерческий препарат)
Ниже приводится метод приготовления цитогенетических препаратов. Для этого клетки, остановленные в метафазе, обрабатывают гипотоническим солевым раствором; набухшие клетки помещают на предметное стекло, после чего распластавшиеся клетки окрашивают и микроскопируют (табл. 4.5).
Рекомендуется следующий порядок подготовки клеток для кариологического анализа:
I. В клетки (например, во флаконах Т-75) на логарифмической фазе роста добавить колцемид до конечной концентрации 0,1—0,4 мкг/мл.
II. Инкубировать 1—6 ч в зависимости от времени генерации изучаемой популяции клеток. Диплоидные клетки человека с относительно продолжительным временем генерации требуют более длительной инкубации с. колцемидом, чем линия быстро пролиферирующих клеток яичника китайского хомячка.
III. Осторожно слейте среду и обработайте клеточный монослой трипсином, как при стандартном пересеве. При работе с суспензионной культурой этот этап опускается. Суспензию открепившихся клеток перенесите в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте сыворотку до конечной концентрации ~ 10% для остановки дальнейшего действия трипсина на клетки.
IV. Осадите клетки центрифугированием, отбросьте супернатант и ресуспендируйте осадок в гипотоническом растворе КС1 при 37 °С.
V. После 10—15 мин инкубации при 37 °С соберите клетки центрифугированием при 100 g в течение 10 мин и отбросьте супернатант, ресуспендируйте клетки в небольшом объеме (примерно 1—2 объема клеточного осадка) гипотонического раствора КС1.
VI. Медленно добавьте 5 мл свежеприготовленного фиксатора при постоянном перемешивании (пипетированием, встряхиванием или с помощью вортекса).
VII. Через 20 мин или более осадите клетки центрифугированием, отбросьте супернатант и ресуспендируйте клетки в
5 мл свежего фиксатора. Дайте суспензии постоять при комнатной температуре в течение 10—15 мин.
VIII. Повторите этап (VII), осадите клетки центрифугированием при 100 g в течение 2 мин, отбросьте супернатант и ресуспендируйте клетки в небольшом объеме (примерно 10—15 объемов клеточного осадка) свежего фиксатора.
IX. Для приготовления препаратов нанесите суспензию по каплям на чистое, холодное (4°С) предметное стекло, наклоненное под углом 45°; слегка покачивая стекло, дайте суспензии растечься по поверхности и высушите на воздухе при комнатной температуре.
X. Обследуйте препарат в фазово-контрастном микроскопе.
Метафазные пластинки должны быть равномерно и без
перекрывания распределены по поверхности стекла. Плотность клеток на стекле можно регулировать, меняя число капель суспензии или изменяя концентрацию клеток в суспензии.
XI. Теперь можно окрасить препарат либо ацетоорсеином в
течение 3—5 мин, либо по Гимза в течение 10—15 мин;
ополосните водопроводной водой и высушите на воздухе.
При желании можно заключить клетки в Пермаунт под покровное стекло.
Частота артефактов при использовании этого метода зависит от линии исследуемых клеток, а также от опыта экспериментатора. В процессе подготовки препаратов может, например, происходить разрушение клеток, сопровождающееся потерей или приобретением хромосом. Однако при подсчете хромосом на 50—100 метафазных пластинках и определении модального числа хромосом цитогенетик получит правдоподобную оценку истинного значения для данной линии клеток. Характерные значения для сотен клеточных линий приведены в каталоге видов II АТСС [8].
Для построения кариотипа изображения хромосом следует вырезать из микрофотографии и расположить их в соответствии с длиной плеч, положением центромер, присутствием вторичных перетяжек и т. д. Полученный кариотип можно сопоставить с данными атласа хромосом млекопитающих [12], включающего кариотипы более 550 видов млекопитающих. Для более точного кариотипического анализа требуется применение метода окраски на G-сегменты (см. разд. 4.3.3).
