Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
При достижении равновесия скорость роста (ц) становится равной скорости разведения (D). Скорость разведения является функцией скорости тока среды в единицу времени (f) и объема культуры (V)
(*=D=f/Vcyr1 (8)
Поскольку скорость роста зависит от скорости тока среды, можно вычислить среднее время генерации (удвоения) клеток:
td = ln2/D (9)
Альтернативной хемостату системой является турбидостат, в котором плотность клеток поддерживается на определенном уровне путем изменения поступления среды. Плотность клеток (мутность суспензии) измеряется обычно с помощью фотоэлектрического устройства. Когда значение плотности снижается ниже заданного уровня, поступление среды приостанавливается, чтобы дать возможность увеличиться числу клеток. При превышении заданной плотности поступление среды увеличивается, чтобы смыть лишние клетки. Эта система эффективно функцио-
нирует только при скоростях роста, близких к максимальным. В этом на самом деле и заключается преимущество турбидоста-та над хемостатом, поскольку последний значительно менее эффективен или контролируем при скоростях роста клеток, близких к максимальным. Более подробно с культивированием животных клеток при постоянном протоке можно ознакомиться, обратившись к обзору Тови [21].
4.6.2. Оборудование
Полная система хемостата может быть получена от любой из фирм, изготавливающих ферментёры. Такую систему, однако, можно легко создать и в лаборатории (рис. 3.13) [22]. Культуральный сосуд должен иметь боковое горло на требуемом
Рнс. 3.13. Культуральная система с постоянным протоком. К — культуральный сосуд с водяной рубашкой; ВБ — водяная баня и система циркуляции; И — сосуд для избытка среды; Р — резервуар; Н — насос; П — устройство для отбора проб; С — бюретка для измерения скорости тока жидкости; М —
магнитная мешалка.
уровне жидкости, который должен располагаться примерно на половине высоты сосуда. Если отсутствует термостатированная при 37 °С комната, можно обойтись водяной рубашкой. Во всем остальном система требует стандартного лабораторного оборудования. Закупорку сосудов можно производить силиконовыми пробками или пробками из белой резины, вставляемыми в отверстия сосудов. Рекомендуется использовать перистальтический насос высокого качества на уровне насосов фирмы Wat-scn-Marlow.
4.6.3. Протокол эксперимента
Для выращивания в рассматриваемой системе рекомендуются клетки LS, HeLa-S3 или постоянные линии лимфобластоид-ных клеток, таких как L1210. В качестве рост-лимитирующего фактора может быть выбрана какая-либо аминокислота или глюкоза.
I. Внесите в культуральный сосуд клетки в концентрации 105 клеток/мл в предпочитаемой вами среде (например, в МЕМ с 10% сыворотки и рост-лимитирующим фактором).
II. Выбранная скорость разведения устанавливается через 24—48 ч после начала роста. Максимальная скорость разведения не должна превышать максимальную скорость роста выбранной линии клеток, которая обычно лежит в диапазоне 14—27 ч (хотя некоторые линии клеток могут удваивать свое количество в течение 9 ч). Следовательно, скорость разведения может изменяться в пределах от
0,1-сут-1 (td — 166 ч) до 1,2-сут"1 (td =14 ч).
III. Равновесие культуры достигается в течение 100—200 ч культивирования, хотя это время может растянуться до 400 ч, особенно при низкой скорости разведения. Достижение равновесия можно определить по отсутствию изменений концентрации клеток в течение суток в пределах экспериментальной ошибки.
IV. Культура может поддерживаться неограниченно долго при условии сохранения стерильности и сохранности всех компонентов. Тем не менее следует время от времени прекращать культивирование при чрезмерном прикреплении клеток к сосуду па границе воздушной и водной фаз. Удовлетворительным считается период культивирования 1000 ч.
V. После достижения равновесия можно изменить скорость протока и изучать ответ клеточной популяции в процессе установления нового равновесного состояния.
VI. Помимо рутинного подсчета числа клеток можно также провести измерения гомогенности клеток и среды. Так, например, должны быть хорошо совпадающими размер и химический состав клеток. Можно измерять также концентрацию некоторых компонентов среды (например, глюкозы, какой-либо аминокислоты, молочной кислоты) для демонстрации постоянства культуры в течение долгого периода времени.
4.6.4. Области использования
а) Легко доступный постоянный источник клеток.
б) При достижении оптимальных условий или того или иного физиологического состояния можно использовать культу-
ру для генерации продукта, как уже было показано для вирусов и интерферона [21J. Для многих целей требуется 2-этапный хемостат, поскольку разные оптимальные условия могут потребоваться для роста клеток (1 этап) и образования продукта (2 этап).
4.7. Ферментёр с эрлифтом
Устройство ферментёра с эрлифтом основано на принципе колонки с пробулькиванием воздуха как для перемешивания, так и для аэрации культуры. Вместо механического перемешивания клеток к основанию культурального сосуда поступают пузырьки воздуха. Внутренний (создающий тягу) цилиндр помещается внутрь культурального сосуда, и перемешивание осуществляется благодаря тому, что пузырьки воздуха поднимают среду (аэрированная среда обладает меньшей плотностью, чем неаэ-рированпая). Среда и клетки, изливающиеся из верхней части тягового цилиндра, циркулируют затем к его основанию по наружной части сосуда. Количество потребляемой системой энергии (сжатый воздух) очень невелико, силы сдвига отсутствуют, и этот метод представляется идеальным для хрупких животных и растительных клеток. Кроме того, поскольку кислород постепенно поступает в культуру, большое количество пузырьков создает высокую скорость переноса массы. Фирма LH Fermentation поставляет культуральные блоки (такие, как на рис. 3.14) размерами от 2 до 90 л. Одним из недостатков этой системы является более или менее линейное увеличение размеров при увеличении масштабов культивирования (ферментер на 90 л требует помещения высотой около 4 м). Представится ли возможным использовать множественные тяговые цилиндры и тем самым сильно увеличить диаметр сосуда, остается пока экспериментальной задачей.
