Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
1. Подготовьте парные флаконы с площадью поверхности 25 см2 (по два на каждую исследуемую концентрацию лекарства и два для контрольных клеток).
2. Когда культуры достигнут желаемой стадии роста (обычно это середина логарифмической фазы, но иногда это может быть стационарная фаза), добавьте лекарственный препарат в экспериментальные флаконы и растворитель в контрольные. Инкубируйте 1 ч при 37°С.
3. Слейте среду, содержащую препарат, сполосните монослой ФСБ и приготовьте суспензию одиночных клеток путем обычной трипсинизации (см. гл. 1).
4. Подсчитайте количество клеток в каждой суспензии и разведите до концентрации, обеспечивающей образование 100—200 колоний в чашках Петри диаметром 5—6 см. Эта величина зависит от эффективности посева клеток и от действия лекарства. При посеве контрольных, не обработанных лекарством клеток, обладающих эффективностью посева 20%, на чашку следует высевать 500—1000 клеток. После воздействия лекарства в дозе ИД50 следует высевать 1000—2000 клеток на чашку, а после действия лекарства в концентрации ИД90 следует высевать по 5000— 10 000 клеток на чашку. Вначале следует провести пробные посевы:
а) для определения эффективности посева клеток,
б) для приблизительного определения значений ИД50 и ИДэо данного препарата.
В практической работе клетки рассевают в двух разных концентрациях; при одной плотности посева получают примерно ожидаемое число колоний контрольных клеток и клеток, обработанных низкими дозами лекарства, при второй высевают клетки, обработанные высокими дозами лекарства. В среднем диапазоне концентраций лекарственного вещества должно быть некоторое перекрывание наборов чашек, и положение этого перекрывающего диапазона подсказывается обычно опытом исследователя.
5. Посейте соответствующее количество клеток в чашки и поместите их в термостат с 5% С02 при 37°С.
6. Выращивайте клетки вплоть до образования колоний. Для быстро растущих клеток (время удвоения 15—24 ч) образование колоний происходит в течение 7—10 сут, а для медленно растущих клеток (время удвоения 36—48 ч) требуются 2—3 нед. Как правило, при исследовании на выживаемость колонии должны содержать в среднем 1000 и более клеток (10 генераций). По мере увеличения размера колоний скорость их роста замедляется (особенно в случае нормальных клеток), поскольку колонии приобретают тенденцию роста с краев, а более медленно растущие колонии уплотняются. Поэтому если главным исследуемым параметром является пролиферация клеток (размер колоний), то клональный рост следует оценивать после более короткого периода инкубации, когда колонии имеют меньший и более широко варьирующий размер.
7. Ополосните чашки ФСБ, зафиксируйте метанолом или глу-таровым альдегидом и окрасьте 1%-ным кристаллвиоле-том. Промойте проточной водопроводной водой, затем дистиллированной водой и высушите.
8. Подсчитайте колонии, превышающие размером нижнюю пороговую величину и переведите полученные результаты в проценты от контроля. Постройте график зависимости полученных значений в логарифмической шкале от концентраций лекарства.
II. Эффективность клонирования в мягком агаре с использованием системы двойного агарового слоя. Приведенная процедура использует 1-часовой период обработки лекарством и требует четырех повторов на каждую экспериментальную точку.
1. Подготовьте чашки Петри диаметром 35 мм с 1 мл базального слоя 0,5%-ного агара в ростовой среде. Для этого 1%-ный агар (расплавленный путем кипячения или авто-клавирования) смешайте при 45 °С с равным объемом ростовой среды двойной концентрации и предварительно прогретой пипеткой разлейте на чашки по 1 мл.
2. Приготовьте суспензию одиночных клеток из популяции,
выбранной в качестве мишени (см. гл. 1 и 6). Концентра-
ция клеток в ростовой среде должна в 20 раз превышать конечную концентрацию, используемую для посева; суспензию клеток вплоть до использования следует хранить при 4°С.
3. Приготовьте разведения исследуемого препарата в ростовой среде в объеме 900 мкл каждой концентрации в пар-
ных пробирках, включая контрольные пробирки, содержащие только среду и соответствующие контроли с растворителем. Поскольку клетки обрабатываются несколькими исследуемыми лекарствами в широком диапазоне концентраций и опыт занимает значительное время, рекомендуется проводить дополнительные контрольные посевы в начале, в середине и в конце каждого эксперимента. Такие контроли помогут скорректировать вариабельность результатов, обусловленную длительным периодом проведения опыта.
4. Убедитесь, что исходная суспензия по-прежнему представлена отдельными клетками, и внесите в каждую пробирку по 100 мкл суспензии клеток.
5. Инкубируйте пробирки при 37°С в течение 1 ч (см. разд. 9.2).
6. По окончании инкубации осадите клетки центрифугированием (2 мин при 100 g) и промойте их 5 мл солевого раствора. Повторите процесс отмывания и суспендируйте осадок клеток в 2 мл ростовой среды. Для поддержания жизнеспособности клеток в ходе опыта храните их во льду.
