Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
I. Модификации. Следующая процедура предложена для определения включения 3Н-тимидина в ДНК клеток, растущих в суспензии над мягким агаром [37].
I. Добавьте к клеткам 25 мкл [метил:-3Н]-тимидина (6,7 Ки/ммоль, разведенного ФСБ до 75 мкК^и/мл) на 24 ч.
II. Соберите клетки и промойте их фосфатным Сбуфером.
III. Добавьте к промытым клеткам 5%-ную ТХУ' при 4°С и оставьте на 30 мин.
IV. Центрифугируйте и повторите этап (III) в речение 10 мин.
V. Промойте метанолом.
VI. Ресуспендируйте осадок в 0,5 мл десятикратного гиамин-гидроксида и прогрейте 1 ч при 60 °С.
VII. Перенесите в 12 мл сцинтилляционной жи:дкости и просчитайте.
9.4.5. Общий синтез ДНК, определяемый по включениио 1251-ЙУДР
В основе метода лежит публикация [39].
I. Добавьте 1251-ИУДР в среду монослойной ку.льтуры до концентрации 0,06 мкКи/мл и инкубируйте 24 ч.
II. Трижды промойте культуры солевым раствором и добавьте свежую среду.
III. Через 6 ч повторите промывку для удаленшя невключив-шейся метки и метки, высвобождающейся из лизирован--ных мертвых клеток. Подсчет связанной с клтетками радиоактивности проводите в ^-счетчике.
Как и в случае испытаний на микротитровальн ых пластинках не следует допускать образования полного монослоя в контрольных пробах. Избыточная плотность ведет к сжижению включения 1251-ЙУДР, а это будет отражаться на оцешке гибели клеток. Когда клетки выращиваются в виде моноослоя в наклонных пробирках, максимальное количество клеток составляет около 2-105, минимальное — 2-104 клеток.
10. Интерпретация результатов
10.1. Взаимосвязь между количеством клеток и индексом цитотоксичности
Объективность индекса цитотоксичности зависит от линейной зависимости между числом клеток и исследуемым признаком цитотоксичности; наличие линейности следует устанавливать во всех тестах на цитотоксичность. В исследованиях на клонооб-разование линейность может нарушаться: при низкой плотности эффективность клонирования повышается благодаря наличию в среде кондиционирующих факторов; при высокой плотности — понижается из-за истощения питательных веществ. В опытах по определению цитотоксичности отклонения от линейности при высокой плотности клеток могут быть обусловлены зависящим от плотности подавлением соответствующего метаболического процесса; при малом числе клеток причиной отклонения от линейности может быть предел чувствительности опыта. Это приводит иногда к появлению кажущейся стимуляции при низкой концентрации лекарств и к завышению оценки гибели клеток при высокой концентрации лекарств. Следовательно, число клеток в контроле к концу испытания должно попадать на линейный участок кривой. При высоком уровне гибели клеток точность измерения зависит от диапазона, в котором эта линейность сохраняется; от точности измерения зависит также и количество погибших клеток. Если результаты отложены в логарифмической шкале, это означает, что опыт обеспечивает точные результаты при гибели 3—4 порядков клеток. Это следует подтвердить, прежде чем прибегать к такому способу выражения результатов. Особое значение это имеет при исследовании действия комбинаций лекарств in vitro, когда синергизм или аддитивность часто проявляются после снижения количества клеток на два порядка.
10.2. Кривые зависимости полученных результатов от концентрации
В опытах по определению цитотоксичности результаты обычно представляются в форме кривых зависимости эффекта от концентрации. При изучении подавления какого-либо процесса для регистрации полученных результатов необходима линейная шкала; в опытах по определению эффективности клонирования обычно пользуются логарифмической шкалой. Ошибки опыта для параллельных точек выражают как среднее зна-чение±среднеквадратичное отклонение; для получения каждой такой точки необходимо, следовательно, не менее трех параллельных результатов. Некоторые средние значения могут потре-
Концентрация лекарства (миг/мл)
Рис. 8.8. Интерпретация результатов с использованием линейного графика зависимости ответа от концентрации лекарства. ИДв0 я ИД90 — концентрации, требующиеся для снижения жизнеспособности клеток до 50 и 90% от контрольного значения соответственно. Точками выделена площадь под кривой между 0 и 1 мкг/мл (для максимальной концентрации в плазме 10 мкг/мл). Ч — граница чувствительности. Р — граница резистентности. П — промежуточная зона. •—• — чувствительная популяция; О—О — промежуточная популяция; ¦ — резистентная популяция.
боваться для определения чувствительности популяции клеток сравнительно с другими клеточными популяциями или для различных условий опыта. На рис. 8.8 представлены способы получения некоторых параметров.
10.2.1. Площадь под кривой (ППК)
Использование ППК отражает идею о том, что форма кривой зависимости эффекта от концентрации может быть более показательной при назначении химиотерапии, чем количество клеток, погибших при какой-либо одной концентрации лекарства. Величина ППК вычисляется методом трапеций, при котором суммируются площади прямоугольников и треугольников под кривой выживания. Наиболее широкое применение этот метод нашел в программе «Испытания стволовых клеток опухолей человека» [56].
