Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
I. Проведите все манипуляции согласно протоколу разд. 9.4.2 (I) — (X), используя 355-метионин (42 Ки/моль) в концент-
рации 5 мкКи/мл для мечения клеток на этапе (IV). Может быть использован и 3Н-лейцин, но в таком случае требуется более длительная экспозиция с рентгеновской пленкой.
II. Добавьте в каждую лунку по 50 мкм сцинтилляционной жидкости, приготовленной на основе толуола, и центрифугируйте открытые чашки в держателе микротитровальных пластинок при 800 об/мин в течение 1 ч при комнатной температуре. Этот метод обеспечивает равномерное испарение сцинтилляционной жидкости, в результате чего на дне лунок создается плоский слой сцинтиллятора, улучшающий разрешение. Толуольный сцинтиллятор может быть заменен салицилатом натрия, что позволяет избежать растворения материала пластинок и образования при испарении токсичных паров толуола.
III. Перенесите пластинки в темную комнату и установите их на листы рентгеновской пленки. Установите прижимную плиту из металла или стекла с прокладкой из полиуретановой губки и зафиксируйте липкой лентой или специальными зажимами. Установите пластинки в темный ящик с влагопоглотителем. Пять дней экспонирования обеспечат поглощение 0,92 при плотности клеток 3000 на лунку после инкубации с 355-метионином (84 Ки/моль) в концентрации 10 мкКи/мл.
IV. Проявите пленку 5 мин в проявителе Кодак D19 при 20 °С. Фиксируйте раствором Илфофикс в течение 4 мин, промойте 2 мин в осветляющем растворе Гипо и затем 5 мин в проточной водопроводной воде. Высушите пленку.
V. Для количественной оценки результатов просканируйте изображение в микроденситометре (например, Хромоскан Joyce Loebl, Gateshead, UK) с тонкослойной приставкой, используя кольцевую апертуру 11 мм и синий фильтр (465 нм). Значения ИД5о могут быть получены непосредственно по результатам определения оптической плотности.
9.4.4. Включение 3Н-нуклеотидов в ДНК и РНК
Следующая процедура описывает систему определения цитотоксичности лекарственных препаратов, занимающую 3 ч.
I. Концентрация клеток в суспензии должна в 10 раз превышать конечную концентрацию живых клеток (обычно 105— 5-105 клеток/мл).
II. Добавьте разведения растворов лекарств (по 900 мкл на пробирку), используя по три параллели на каждую концентрацию лекарства, включая соответствующие контроли. Добавьте в каждую пробирку по 100 мкл клеточной суспензии.
III. Инкубируйте пробы при 37°С в течение 2 ч (см. разд. 9.2) и в конце второго часа добавьте изотоп (2,5 мкКи/мл). Можно использовать 6-3Н-уридин (22 Ки/ммоль), метил-3Н-тимидин (5 Ки/ммоль) или 6-3Н-дезоксиуридин (25 Ки/ммоль). Инкубируйте в течение 1 ч.
IV. Клетки отцентрифугируйте и 3 раза промойте ФСБ для удаления лекарств и изотопа. Важно тщательно промывать клетки, чтобы удалить не включенную радиоактивность.
Дальнейшая подготовка препаратов определяется наличием того или иного оборудования. Наиболее простой и надежный метод заключается в фильтрации клеток на фильтрах из стеклянных волокон под вакуумом, экстракции клеток ТХУ, промывке и высушивании. Для выполнения этих операций выпускается целый ряд приспособлений, включая приспособление для фильтрования, устанавливаемую на колбу Бюхнера (Milli-pore UK, Ltd.) головку для одновременного фильтрования многих проб (Millipore UK, Ltd.) и многочисленные устройства для автоматического сбора образцов с микротитровальных пластинок, снабженные адапторами для пробирок (Flow Laboratories, Dynatek, Ilacon). Приспособления для фильтрования одного образца непригодны в случае обработки многих препаратов из-за значительного времени, расходуемого на каждый образец. Основная процедура заключается в следующем.
I. Соберите клетки на фильтровальную бумагу из стекловолокна, используя 2—3 смыва культурального сосуда для полного сбора клеток.
II. Промойте фильтры 5 мл ледяной 10%-ной ТХУ 3 раза.
III. Для удаления воды промойте фильтры последовательно метанолом, смесью метанола с эфиром и эфиром.
IV. Высушите фильтры и перенесите их в сцинтилляционные флаконы с 10 мл эмульсифицирующей сцинтилляционной смеси (например, Beckman Ready Sol HP [High Performance] ).
V. Перед счетом выдержите флаконы в темноте в течение, по крайней мере 1 ч для гашения хемилюминесценции, завышающей счет.
VI. Просчитайте образцы в течение 5—10 мин или более длительного времени, обеспечивающего среднеквадратичную ошибку счета ниже ±5%.
В прекрасном обзоре [55] подробно описаны проблемы, связанные с использованием систем гетерогенного сцинтилляцион-ного счета, аналогичных описанной выше.
Если в распоряжении исследователя нет устройств для фильтрования, то обработку препаратов следует проводить в стеклянных культуральных сосудах.
I. Осадите промытые клетки центрифугированиеем.
II. Добавьте 1 мл ледяной 10%-ной ТХУ, ре>суспендируйте клетки и дайте им осесть в ледяной бане в тгечение 5 мин, вновь отцентрифугируйте и дважды повторите экстракцию ТХУ.
III. Промойте осадок метанолом, смесью метаанол — эфир и эфиром и высушите.
IV. Добавьте к осадку 1 мл сцинтилляционнош жидкости и после растворения перенесите в сцинтилляциоонный флакон. Доведите объем до 10 мл и просчитайте, как: было указано выше.
