Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
7.3.1. Клснмрмание в монослое
Эффективность клонирования клеток в монослое, как правило, выше, чем в мягком агаре, поэтому этот метод часто используется при работе с линиями клеток. Нормальные и опухолевые клетки могут образовывать колонии в монослое, так что этот метод неприменим к биопсийному материалу опухолей, который обычно характеризуется высоким уровнем примесей клеток стромы. Метод клонирования в монослое биопсий опухолей
возможен, если есть способ различать опухолевые клетки и клетки стромы. Для увеличения эффективности посева часто используется фидерный слой облученных или обработанных мито-мицином С клеток; улучшение условий культивирования благодаря наличию фидерных клеток часто оказывается благоприятным для выявления небольших фракций клеток, резистентных к лекарственным препаратам [44].
7.3.2. Клонироввние в мягком агаре
Достоинства и недостатки этого метода обсуждались уже в разд. 3.1.5.
7.3.3. Сфероиды
Для количественной оценки действия лекарств на сфероидальный рост клеток можно использовать разные методы. К числу таких методов относятся:
I. относительные изменения объемов обработанных и необработанных сфероидов;
II. эффективность клонирования дезагрегированных сфероидов в мягком агаре;
III. пролиферация клеток из сфероидов, прикрепленных к поверхности культурального сосуда.
Первый метод относительно малочувствителен, поскольку рост сфероидов имеет тенденцию к насыщению. Сложность дезагрегации до суспензии одиночных клеток и низкая эффективность посева делают трудным и второй метод. Конечный результат определяется главным образом индивидуальными особенностями изучаемых сфероидов.
7.3.4. Пролифервция клеток
Увеличение количества клеток в пролиферирующей клеточной линии можно рассматривать как показатель нормального поведения. Можно построить кривые роста культуры и определить время ее удвоения на стадии экспоненциального роста. Увеличение времени удвоения может служить указанием на цитотоксичность, хотя следует помнить, что получаемые результаты отражают усредненные параметры, поэтому на основании этих данных нельзя отличить снижение скорости роста всех клеток ът гибели части клеток в каждой клеточной генерации. Для оценки цитотоксичности по изменению числа клеток в массовой культуре следует рассматривать всю кривую роста. Если 50% клеток гибнет в начале эксперимента, то скорость роста оставшихся клеток, определяемая на логарифмической фазе, может оказаться неизменной, но характеризоваться некоторым
Таблица 8.3. Обобщение результатов исследований, предпринятых для сравнения результатов по эффективности клонирования и цитотоксичности
Авторы
Сравниваемые методы
Использованные
клетки
Результаты
Ропер, Древии-ко [34]
Твейт с сотрудниками [26]
Морган с со трудииками [18|
Вилсои с со трудниками [45]
Вейзенталь с сотрудниками [17]
Фридмаи и Глаубигер [371
Высвобождение 51Сг, отторжение красителя, индекс метки, кинетика роста
Системы «Куртеней» и «Сал-мои» в мягком агаре
Клонирование в моиослое и микротитроваль-иый тест (разд. 9.4.2 и 9.4.3)
Кратковременное биохимическое испытание и микротитроваль-иый тест (разд. 9.4.4)
Отторжение красителя
Определение включения 3Н-тимидина в суспензии над мягким агаром
Лимфома Т,
Меланомы: ксено-траисплантаты и биопсийный материал
Астроцитома человека
Линии клеток (Т13 и MCF7)
Линии клеток опухолей животных
Биопсийный мате риал опухолей
Эффективность клонирования —¦ единственный достоверный зависимый от дозы показатель эффекта лекарственных препаратов Результаты чувствительности несравнимы. Система «Сал-мои» обеспечивает большую чувствительность Хорошая корреляция. Метод клоиироваиия позволяет выявить небольшие фракции резистентных клеток
Результаты сравнения зависят от лекарства н продолжительности воздействия Точки отсечения, выбираемые по результатам предварительных даииых, дают сравнимые результаты Качественное соответствие результатов по отторжению красителя и определению эффективности клоиироваиия
89% корреляции между включением тимидииа и испытанием по программе «Стволовые клетки опухолей человека»
запаздыванием. На практике оказывается очень трудно различить раннюю потерю клеток и увеличение лаг-периода, в течение которого клетки просто адаптируются. По этим причинам изменение скорости роста клеток следует рассматривать только как намек на возможность цитотоксического действия, и точное
определение выживания и пролиферации клеток следует проводить на основе эффективности клонирования (выживание) и определения размера колоний (пролиферация).
7.3.5. Общее содержание белка
Определение количества белка является относительно простым методом оценки числа клеток. Этот метод особенно удобен в монослойной культуре, и важное его преимущество заключается в том, что промытые препараты могут храниться долгое время в замороженном виде; это не искажает конечный результат и облегчает скрининг. Завышенная оценка числа клеток может иметь место при изучении действия некоторых препаратов, подавляющих репликацию, но не влияющих на синтез белка (например, 5-бромдезоксиуридин и метотрексат). Для монослойной культуры была разработана специальная модификация метода Лоури, использующая феноловый реагент фолина [30]. Рекомендуется также метод с амидо-черным, при котором линейность стандартной кривой сохраняется в более широком диапазоне концентраций [3]. Вывод о цитотоксичности при использовании этого метода можно делать, если изменение накопления белка в культуре в течение времени показано в нескольких точках; если же точка одна, то воздействие лекарственного препарата должно быть длительным и должен существовать период восстановления.
