Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
7. Центрифугируйте пару пробирок с одной концентрацией лекарства. Удалите среду и добавьте в каждую пробирку по 2 мл теплой свежей среды, содержащей 0,3% агара. Осторожно суспендируйте клетки так, чтобы не осталось агрегатов, и посейте по 1 мл суспензии на каждую из
4 подготовленных чашек с агаром. Эту процедуру легче всего производить с помощью микропипеток на 1 мл (Finn или эквивалентные им пипетки). Для удобства работы с затвердевающим агаром у таких пипеток следует отрезать кончик (~2 мм).
8. Поместите чашки на охлаждаемую горизонтальную поверхность для затвердевания агара.
9. Повторите операцию для всех условий воздействия, включая контрольные суспензии на соответствующих этапах опыта.
10. Инкубируйте чашки во влажной атмосфере 95% воздуха и 5% С02.
11. Когда колонии в контрольных чашках дорастут до заданного размера, подсчитайте их число. При работе с линия-
ми клеток колонии должны содержать более 50 клеток. Медленно растущие клетки с низкой эффективностью посева (клетки биопсий опухолей человека) обычно образуют колонии из 20—30 клеток.
III. Модификации
1. Метод «Куртеней». Для клонирования клеток в суспензии [51] в качестве фидерных клеток используются эритроциты крыс и поддерживается парциальное давление кислорода 5%. Может быть использована описанная выше процедура с соответствующими модификациями условий окончательного посева.
2. Фидерные клетки. При увеличении количества клеток может не соблюдаться пропорциональность между эффективностью посева и числом высеваемых клеток. Когда под действием лекарств происходит лизис клеток, то снижение их числа может сопровождаться непропорциональным снижением эффективности посева, что скажется на наблюдаемой эффективности клонирования значительно сильнее, чем снижение клоногенности остающейся популяции клеток. Эта проблема может быть решена путем использования гомологичных фидерных клеток. Эти клетки не пролиферируют, поскольку облучены летальными дозами 60Со или 137Cs или проинкубированы в течение 12 ч с митоми-цином (2 мкг/106 клеток). Дозу облучения следует экспериментально устанавливать для каждого типа клеток (например, 2000—3000 рад для лимфоцитов и 6000 рад для линий лимфоидных клеток).
3. Использование 2-(п-иодофенил)-З-(п-нитрофенил) -5-фенил тетразолийхлорида (ИНТХ). Живые клетки восстанавливают бесцветные соли тетразолия до водонерастворимых окрашенных формозановых соединений. Эта реакция используется при подсчете для дифференциации колоний жизнеспособных клеток и агрегатов погибших клеток. Следует иметь в виду, что жизнеспособные колонии могут дегенерировать из-за истощения среды, что иногда искажает конечные результаты. Краситель готовится путем растворения ИНТХ-фиолетового в забуференном солевом растворе в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Растворение происходит медленно, так что краситель следует начинать готовить за 24 ч до использования. В каждую чашку Петри диаметром 35 мм добавляют 0,5—-1 мл красителя и инкубируют в течение ночи при 37°С. Живые колонии окрашиваются в красновато-коричневый цвет.
4. 20% 02 или 5% 02. Для проведения клоногенных исследований рекомендуется более низкое парциальное давление кислорода, которое ближе к физиологическому. При снижении концентрации кислорода увеличивается эффек-
тивность клонирования. Показано, что кислород модифицирует чувствительность клеточных популяций к химиотерапевтическим препаратам [52], усиливая их цитотокси-ческое действие.
9.3.2. Сфероиды
Приведенная ниже экспериментальная методика основана на технике, описанной в недавней публикации [53]. Для определения цитотоксического эффекта лекарств на сфероиды могут быть использованы три конечных критерия: (а) замедление роста объема; (б) рост клонов; (в) разрастание клеток в форме монослоя. Независимо от выбранного нами критерия начальные этапы испытания (предварительный отбор сфероидов одинакового размера и инкубация с лекарством) оказываются общими.
I. Предварительный отбор сфероидов определенного размера. Сфероиды с диаметром 150—250 мкм видны невооруженным глазом и отбираются с помощью пастеровской пипетки.
II. Процесс инкубации с лекарством в известной степени зависит от продолжительности воздействия. Если препарат добавляется на 1 ч, что случается наиболее часто, сфероиды инкубируют в чашках Петри или универсальных стеклянных контейнерах, покрытых агаром (0,5—1%). При более длительном воздействии сфероиды инкубируют во вращающихся сосудах, что поддерживает их в суспендированном состоянии и препятствует прилипанию к стенкам сосуда.
III. По окончании инкубации промыть сфероиды двумя-тремя сменами среды, не содержащей лекарства, по 5 мин каждой.
I. Замедление роста объема. Обработанные лекарственным средством сфероиды можно выращивать в массовой культуре и через различные интервалы времени определять объем отдельных, случайно выбранных сфероидов. Однако для облегчения статистической обработки рекомендуется проводить последовательные измерения на индивидуальных сфероидах, помещенных на слои агара в лунки 24-луночных или 96-луночных пластинок. Более мелкие лупки могут быть использованы для сфероидов диаметром до 600 мкм.
