Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Другие признаки цитотоксичности, оцениваемые по изменению метаболических процессов, могут быть измерены более точно. Однако предсказание выживаемости клеток на основе этих параметров может быть более неопределенным, поскольку многие формы подавления метаболизма оказываются обратимыми. В этих случаях угнетение выживания клеток может реализоваться, только если подавление скорости включения предшественников в ДНК, РНК или белок будет постоянным в течение нескольких клеточных циклов.
7.2.1. Целостность мембран
Этот тест относится к наиболее распространенным методам оценки жизнеспособности клеток непосредственно во время опыта. Результаты исследования позволяют оценивать мгновенные повреждения (например, при замораживании и оттаивании клеток) или повреждения, прогрессирующие в течение нескольких часов. Их количественная оценка может быть затруднена вследствие потери погибших клеток из-за открепления от субстрата или аутолиза.
I. Высвобождение Ъ1Сг. Обработка клеток 51Сг приводит к ковалентному связыванию хромата основными аминокислотами внутриклеточных белков. Эти меченые белки высвобождаются из клеток при повреждении клеточных мембран; скорость высвобождения пропорциональна степени повреждения. Метод
нашел широкое применение в иммунологических исследованиях для определения активности цитотоксических Т-клеток против опухолевых клеток-мишеней. Естественное высвобождение 51Сг из неповрежденных клеток оказывается достаточно высоким, так что опыт следует проводить в течение не более 4 ч после загрузки клеток 51Сг. Результаты сравнительного исследования [34], использующего высвобождение 51Сг в качестве конечного продукта цитотоксического действия лекарств, показали непригодность этого метода для оценки истинной цитотоксичности.
II. Отторжение красителя. К прижизненным красителям, используемым для оценки целостности мембран, относят трипановый синий, эозин Y, нафтоловый черный, нигрозин (зеленый), эрит-розин В и зеленый прочный. Для оценки жизнеспособности более надежным способом является окрашивание клеточных суспензий, поскольку при окрашивании прикрепленных клеток они могут открепляться от субстрата и теряться. Главным недостатком этого метода является невозможность выявления клеток с нарушенной способностью к размножению. Так, было показано, что клетки, не способные к клонообразованию, характеризуются 100%-ной выживаемостью при тестировании на отторжение красителя [34]. Метод, однако, удалось обновить, и введенные в него технические усовершенствования позволили в какой-то степени разрешить присущие ему проблемы. В методе, предложенном Вейзенталем с сотрудниками [35], выбран 4-дневный период исследований, в течение которого клетки с нарушенной способностью к размножению теряют целостность мембран. Артефакты, связанные с размножением жизнеспособных клеток или лизисом погибших клеток, корректируются путем добавления в суспензию фиксированных утиных эритроцитов в качестве внутреннего стандарта. При сравнении трех методов анализа: подсчет клеток, определение жизнеспособных клеток и определение отношения числа жизнеспособных клеток к числу эритроцитов — выявляется повышенная чувствительность последнего метода (рис. 8.5). Этот метод с равным успехом был применен к солидным опухолям, клеткам выпотов и злокачественным клеткам крови.
7.2.2. Дыхание и гликолиз
Изменения дыхания (поглощение Ог) или гликолиза (образование С02), индуцируемые лекарствами, оценивают с помощью аппарата Варбурга; оба этих параметра характеризуются подавлением, зависимым от дозы лекарства [31, 32]. Ряд авторов определяет активность дегидрогеназы, смешивая метиленовую синьку с агаром, содержащим клетки, обработанные лекарством. Гибель клеток регистрируется по отсутствию восстановления красителя в их окрестностях [33]. Недостаток послед-
4 “ ¦ Количество клеток
Живые клетки/эритроциты утки
% жизнеспособности
J-----1----1---1____I____1____I____1
0 1 2 3 4 5 6
Дни после добавления доксорувицина
Рис. 8.5. Влияние доксорубицина (0,12 мкг/мл/ч) иа клетки MDAY-D2, оцениваемое с помощью трех различных методов. Подсчет в автоматическом
счетчике частиц Каултер (-------------) (по оси ординат отложено количество
клетка/мл XIО4); отношение числа живых опухолевых клеток к числу утиных эритроцитов, иормироваиное к той же шкале, что и подсчеты в счетчике Каултер (----------------------); доля жизнеспособных клеток в %
(--------). По оси ординат отложен % жизнеспособности (число живых
клеток/общее число Х100%). • — контрольные культуры; О — обработанные доксорубицнном культуры. (Воспроизводится с разрешения издателей
[35].)
него метода заключается в невозможности количественного его осмысления, тогда как использование аппарата Варбурга, хотя и позволяет получить количественные оценки, но не находит широкого распространения из-за технических трудностей.
