Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
1. В отдельные лунки посейте опытные и контрольные сфероиды из следующего расчета: 24 контрольных сфероида и по 12—24 сфероида на каждую концентрацию лекарственного препарата. Для 24-луночной пластинки используйте в качестве подложки 0,5 мл 1%-ного агара и добавляйте сфероиды в 1 мл ростовой среды.
2. С интервалом 2—3 дня измеряйте с помощью окуляр-мик-рометра в инвертированном микроскопе два перпендикулярных диаметра (X, Y) сфероидов. Размер сфероидов рассчитывайте либо как «средний диаметр» (fXY), либо как «объем»:
[¦И^л
Полученные значения используйте для построения кривых роста контрольных и обработанных лекарством сфероидов. Результаты обычно относят к размеру сфероидов до обработки и выражают в форме отношения Vt/Vo, где Vt — объем сфероида в момент времени t, a Vo—начальный объем. На рис. 8.7 приведен
пример таких построений
Мелсралан Нх70
Диаметр в начале
Время (дни)
Рис. 8.7. Влияние обработки мелфала-ном в течение 1-го ч на рост сфероидов, полученных из аденокарциномы легких. Vo — объем в начале эксперимента; Vt — объем в момент исследования. Достоверные различия (р<0,001; t — тест Стьюдеита) между контролем и всеми концентрациями мелфалаиа достигаются к 14-му дню культивирования. (Воспроизводится с разрешения издателей [54].)
для сфероидов, полученных из ксенотрансплантата аденокарциномы легких. Метод предполагает симметричность сфероидов. Однако у некоторых клеточных линий наблюдаются расплющивание сфероидов и приобретение ими куполообразной формы, результатом чего является завышение измеряемого объема.
II. Рост клонов.
1. Обработайте сфероиды
0,25%-ным трипсином или 0,125%-ным трипсином в смеси с 1000 ед./ /мл коллагеназы типа I (Worthington) градации CLS и получите суспензию одиночных клеток.
2. Доведите концентрацию клеток до 20— 200 клеток/мл при ис-j пользовании клеточных линий или до 103 клеток/мл при работе с первичными культурами. При клонировании в суспензии используйте концентрации
104 клеток/мл для клеточных линий и 5• 105 клеток/мл при клонировании первичных культур.
3. Подсчитайте число колоний при достижении ими в контроле заданного размера.
III. Монослой клеток, выросших из сфероида. Получение суспензии одиночных клеток из сфероидов часто оказывается невозможным, и эффективность посева этих клеток может быть очень низкой. Для преодоления этих проблем предлагается следующий метод.
1. Дайте индивидуальным сфероидам прикрепиться ко дну лунок микротитровальных пластинок для культуры ткани.
2. Через 2—3 нед удалите центральный сфероид и определите число клеток в монослое, происходящем из сфероида. Это может быть сделано непосредственно путем подсчета числа клеток после их открепления. С другой стороны, можно использовать методы, приведенные в разд. 9.4.2 и 9.4.3 для количественной оценки действия лекарств на монослой клеток.
9.4. Методы определения цитотоксичности
9.4.1. Определение белка в клеточном монослое
Приведенный протокол основан на методике, предложенной Ояма и Иглом [30] для культур, помещенных в пробирки.
Реагенты:
Раствор А карбонат натрия 20 г ^
оксид натрия 4 г I растворите в 1 л дистил-
натрий, калий | лированной воды
тартрат 0,2 г >
Раствор Б сульфат меди 0,5 г
дистиллированная вода 100 мл
Растворы А и Б храните при 4°С.
Раствор В 50 мл раствора А+1 мл раствора В (готовьте
непосредственно перед употреблением)
Раствор Г 1 часть фенольного реагента Фолина
1 часть дистиллированной воды
Для построения стандартной кривой используйте серийные разведения бычьего сывороточного альбумина (10—100 мкг/мл).
I. Трижды промойте клеточный монослой фосфатным буфером.
II. Переверните пробирки и дайте стечь жидкости в течение 20 мин.
III. Внесите в каждую пробирку по 5 мл раствора В и оставьте при комнатной температуре на 20 мин.
IV. Добавьте по 1 мл дистиллированной воды в каждую пробирку с клетками и в контрольные пробирки и по 1 мл раствора альбумина в пробирки для калибровочной кривой.
V. Добавьте по 0,5 мл раствора Г в каждую пробирку шприцем для быстрого перемешивания.
VI. Смешайте содержимое пробирок на мешалке типа Вортекс.
VII. Через 2 ч определите поглощение на колориметре при 660 мкм. В число измеряемых проб включите контрольные пробирки, содержащие 5 мл раствора В, 1 мл дистиллированной воды и 0,5 мл раствора Г. Некоторые белки ростовой среды сорбируются на поверхности стекла и пластика, что и делает необходимым подготовку контролей в пробирках, содержащих ростовую среду и не содержащих клеток. Стандартная кривая отклоняется от линейности при высоких концентрациях белка, так что при высокой плотности клеток может возникнуть необходимость разбавления. Полученные результаты должны быть с помощью стандартной кривой переведены в концентрации белков; затем определяется процентное содержание белка в пробирках, обработанных лекарствами, по отношению к контрольным пробиркам.
