Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
7,2.3. Включение радиоактивных изотопов
Для проверки цитотоксичности тех или иных препаратов часто применяют метод включения радиоактивных изотопов.
I. Нуклеотиды. Наиболее широко используемыми методами количественной оценки цитотоксичности лекарственных веществ являются определения включения 3Н-тимидина в ДНК и 3Н-ури-дина в РНК [Ю, 13, 14, 16]. В кратковременных опытах без периода восстановления эти методы страдают рядом недостатков, связанных с тем, что включение 3Н-тимидина не всегда отражает истинную способность клеток синтезировать ДНК. К числу этих недостатков относятся следующие.
I. наблюдаемые изменения могут отражать изменения внутриклеточных пулов нуклеотидов, а не изменения синтеза ДНК;
II. некоторые препараты, такие как 5-фторурацил и метотрексат, подавляющие путь биосинтеза нуклеотидов de novo, могут увеличить включение 3Н-тимидина благодаря его переносу по «запасному» пути, использующему преформи-рованные пиримидины;
III. синтез ДНК может происходить и в отсутствие включения 3Н-тимидина [36].
Выбор изотопа оказывается в некоторой степени зависимым от типа используемого лекарственного препарата. Так, Вольм с сотрудниками [13] рекомендуют при исследовании действия адриамицина 3Н-уридин, 4-гидроксипероксициклофосфамида — 3Н-тимидин, 5-фторуарацила — 3Н-дезоксиуридин. С другой стороны, в работах Сильвестрини [10] было отмечено, что при оценке действия адриамицина, 4-гидроксипероксициклофос-фамида, цисплатина и митомицина наблюдается сходное снижение включения и 3Н-тимидина, и 3Н-уридина. При исследовании действия блеомицина, винкристина, актиномицина D иУР-16 включение предшественников было различным. Низкий уровень включения нуклеотидов в опухоли человека делает необходимым использование большого количества клеток, что приводит к ограничению спектра испытываемых лекарств и диапазона их концентраций, если количество клеток, лимитировано. Недавно появились сообщения о двух «гибридных» методах, сочетающих в себе преимущества «подавления клеток стромы» культивированием в мягком агаре и количественной оценки, обеспечиваемой применением радиоизотопов. Оба метода требуют промежуточного времени проведения (~4 сут) и используют включение 3Н-тимидина в ДНК- В одном методе клетки выращивают в суспензии над мягким агаром [37], а во втором клетки растут непосредственно в мягком агаре [38].
Если возможно получение гомогенных клеточных популяций, то включение 3Н-нуклеотидов может быть использовано после соответствующего периода восстановления для определения выживаемости или же в присутствии лекарства для измерения его антиметаболического эффекта, но с учетом указанных выше ограничений.
II. Х251-йодурацилдезоксирибозид(иъ1-ЙУДР). 1251-ЙУДР представляет специфическую стабильную метку для новообразованной ДНК, которая минимально реутилизируется и, следовательно, может быть использована для определения скорости синтеза ДНК в течение 24 ч [39]. Количественная оценка процесса облегчается тем, что изотоп является ^-излучателем. К недостаткам следует отнести неодинаковую токсичность препарата для различных клеточных популяций; 1251-ЙУДР необходимо исполь-
зовать в низких концентрациях, а следовательно, приходится брать для анализа больше клеток.
III. 32Р-фосфат (32Р). Скорость высвобождения 32Р в среду из клеток зависит от типа исследуемых клеток и увеличивается в результате их повреждения. Этот факт был использован для оценки эффективности действия лекарств [40J. По включению 32Р в нуклеотиды можно судить и о цитотоксичности лекарственных препаратов. Однако в настоящее время ни один из этих методов не нашел пока широкого применения.
IV. 14С-Глюкоза. Включение глюкозы используется в качестве конечного результата при исследовании цитотоксичности лекарственных веществ, поскольку она является общим предшественником многих биохимических путей [42]. Метод не имеет широкого распространения.
V. 3Н-Аминокислоты. Синтез белка можно рассматривать как незаменимый метаболический процесс, без которого клетка теряет жизнеспособность, поэтому включение аминокислот в белки успешно используется в качестве оценки цитотоксичности. Наиболее распространены исследования клеток, растущих в монослое в лунках микротитровальных пластинок. В этом случае можно оценивать включение 3Н-лейцина [29] с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика или включение 358-метио-нина с помощью радиоавтографии [43].
7.3. Выживаемость (репродуктивная целостность)
Исследования выживаемости позволяют непосредственно изучать гибель размножающихся клеток путем определения эффективности клонирования в монослое или в мягком агаре. Конечные результаты, описанные в предыдущем разделе, могут быть использованы в качестве показателя репродуктивной целостности, если при испытании анализируется также и восстановительный период. Увеличение количества общего белка, числа клеток и белоксинтезирующей активности также может отражать способность к пролиферации. В этих случаях интерпретация более сложна, так как гетерогенная клеточная популяция по-разному реагирует на разные воздействия.
