Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
3.1.5. Клонирование в мягком агаре
Клетки, получаемые непосредственно из опухолей, можно клонировать на стекле в виде монослойной культуры. Однако в последнее время появляется все больше данных о клонировании клеток в суспензии, при котором удается избавиться от стро-мальных элементов, которым необходима для роста твердая подложка. Теоретически преимущество клонирования в суспензии состоит в том, что в такой системе эффектам подвержены лишь клетки с высокой способностью к самообновлению (возможно, стволовые клетки опухолей); клетки с низкой пролиферативной’ активностью, составляющие большую часть опухоли, в формировании ответа не участвуют. Это, однако, справедливо только в том случае, когда колонии представляют собой истинные клоны (то есть возникают из единичной клетки, а не из клеточного агрегата) и подсчет их производится после многих клеточных генераций. В реальных исследованиях эти требова-
ния часто не выполняются. Эффективность клонирования часто составляет 0,01—0,1%, и при этих величинах трудно исключить возможность агрегации. При клонировании на стекле колонии легко получить после 10 генераций (около 1000 клеток), тогда как при клонировании в суспензии подсчет колоний часто проводится после 4—6 генераций (16—64 клетки). Принимая во внимание, что некоторые из этих колоний образуются из агрегатов в 3—4 клетки, число делений клеток в таких колониях часто не превышает двух. В этих условиях трудно что-либо го-
Концентрация лекарства (мнг/мл)
Рис. 8.2. Чувствительность клеток ксенотрансплантата меланомы (V. N.) к ряду лекарственных препаратов. Клетки выращивали в мягком агаре либо (а) по методу Куртеней (О), либо (б) по методу Хэмбургера — Саль-мона (©). Клетки обрабатывали лекарствами в течение 1 ч, высевали с плотностью 3-104 клеток на пробирку или чашку и через 14 дней проводили подсчет колоний. В контрольных культурах при использовании обоих методов насчитывалось ~400 колоний. Метод (б) обладает большей чувствительностью в трех из четырех случаев. (Воспроизводится с согласия
издателей [26].)
ворить о способности клеток к самообновлению. Тем не менее рост в мягком агаре несомненно является полезной тест-системой для линий клеток с относительно высокой эффективностью клонирования. Однако при исследовании солидных опухолей и выпотов, выделенных от пациентов, возникает немало технических проблем, затрудняющих интерпретацию результатов. Перечислим лишь некоторые из этих проблем: из эпителиальных опухолей трудно получить гомогенную суспензию одиночных клеток (что является необходимым условием для определения эффективности клонирования); очень низкая эффективность клонирования (ниже 1%); образование колоний клеток, зависимых от субстрата при определенных условиях роста; потребность в большом числе клеток; субъективная оценка при подсчете колоний. Все это отражает несовершенство современной технологии, а не является недостатком данного метода. Важность разработки методов получения гомогенных суспензий клеток и подбора селективных культуральных сред для различных типов опухолей подчеркивалась в ряде работ [19]. В не-
скольких публикациях [20—22] можно найти критическое рассмотрение технических трудностей, возникающих при проведении программы «Испытания стволовых клеток опухоли человека». В недавнем обзорном сообщении [24] описаны результаты, полученные при использовании «двойного агарового метода», предложенного Хэмбургером с сотрудниками [23]. Альтернативная методология, обеспечивающая более высокую эффективность клонирования, впоследствии была предложена Куртеней
[25]. Твейт с сотрудниками [26] сравнили системы Хэмбургера — Сальмона и Куртеней, и результаты их анализа показали, что используемая методология влияет на результаты определения чувствительности клеток к химиопрепаратам (рис. 8.2).
4. Концентрации лекарственных веществ
Выбор концентрации лекарства определяется тем, какие терапевтические уровни могут быть достигнуты при использовании тех или иных доз этого лекарства в клинике, что практически невозможно при предклини-ческой проверке соединений на их возможную активность. Сравнивая данные об эффективной дозе того или иного вещества in vitro и in vivo, рекомендуется верхний предел концентрации 100 мкг/мл. Для многих используемых в клинике лекарств известны фармакокинетические данные, и для испытаний in vitro существенны такие параметры, как максимальная концентрация в плазме и кривая плазменного клиренса (рис. 8.3). Более подробное описание фармакокинетических проблем можно найти в работе [27]. В руководстве [28] приведены фармакокинетические данные для большинства противоопухолевых химиотерапевтических агентов и в том числе максимальная концентрация в плазме,’показатель СХТ (где С — концентрация и Т — время в часах) и время полужизни (if]/2) лекарства в плазме. При отсутствии фармакокинетических данных можно приблизительно оценить концентрацию вещества в плазме на основе вычислений, предполагающих равномерное распределение лекарства среди всех биологических жидкостей организма (табл. 8.1).
