Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
3.1.3. Суспензионные культуры
I. Кратковременные культуры (4—24 ч). Кратковременное поддержание клеток в суспензии для анализа чувствительности к препаратам возможно для клеток из любого источника. Если клетки получены из биопсийного материала опухоли человека, то тест-система имеет ряд теоретических преимуществ: способность к росту не является лимитирующим фактором, поскольку рост в этой системе не требуется; разрастание клеток стромы и клональный отбор сведены к минимуму, так что результаты могут быть получены быстро, что особенно важно, если испытание проводится с клиническими целями. Метод получил широкое использование в ФРГ при изучении чувствительности к ряду химиотерапевтических препаратов различных типов опухолей [13, 14]. Модифицированный метод с использованием либо клеток, либо фрагментов тканей был применен Силвестрини с сотрудниками [10] также для различных типов опухолей. В обоих вариантах исследовали включение нуклеотидов, меченных тритием, в ДНК или РНК. Ограничения этого метода заключаются главным образом в короткой продолжительности опыта; это исключает возможность длительного воздействия лекарственных средств в течение одного или нескольких клеточных циклов. Следовательно, этим методом нельзя исследовать обратимость действия лекарства и остаточную цитотоксичность, что существенно ограничивает круг исследуемых препаратов. Было показано, что при использовании этой тест-системы получаются ложно-отрицательные результаты действия адриамици-на [И], хотя имелись сообщения об успешном применении системы при анализе действия других лекарств с иными механизмами действия [Ю].
II. Промежуточная длительность (4—7 дней). Суспензионные культуры с промежуточной продолжительностью жизни особенно пригодны при изучении чувствительности к химиотерапевтическим агентам злокачественных кроветворных клеток. Более подробное описание можно найти в нескольких недавно опубликованных исследованиях [15-17].
3.1.4. Монослойные кукьтуры
Метод выращивания клеток в монослое наиболее часто используется при анализе цитотоксичности в клеточных линиях, но иногда он используется при анализе чувствительности биопсий целого ряда опухолей разных типов. Главная проблема, возникающая при работе с биопсийным материалом, заключается
б том, что не всегда удается достигнуть адгезии и пролиферации опухолевых клеток, а кроме того, слишком часто наблюдается зарастание опухолевых культур клетками стромы (фиб-робласты и мезотелий). Важность этих проблем различна для разных типов опухолей (высока для карцином молочной железы, умеренна для опухолей яичников и малосущественна для глиом).
Цисплатин (мкг/мл)
Рис. 8.1. Влияние различного соотношения клеток мезотелия (А) и фибро-бластов (Б) на чувствительность клеток опухоли яичников (линия OAW42) к цисплатину (Э. П. Вилсон, неопубликованные результаты). Р — 10% клеток стромы; 0—30% клеток стромы; Щ — 50% клеток стромы; + — 70% клеток стромы; ф — 90% клеток стромы; О — 100% клеток OAW42; Л — 100% клеток стромы. Определение чувствительности проводилось с помощью опыта на микротитровальных пластинках, как описано в разд. 9.4.2.
Существенным этапом в применении этого метода является тот или иной способ идентификации клеток. Клетки стромы являются наиболее резистентными к химиотерапевтическим агентам, но загрязнение линии клеток опухоли яичника (OAW42) клетками стромы на 30% оказывает очень слабое действие на чувствительность культуры. Следовательно, ответ культуры на химиопрепараты обеспечивается главным образом
опухолевыми клетками. Более высокий уровень загрязнения опухолевых клеток клетками стромы приводит к снижению чувствительности культур. В этой серии экспериментов не было показано, чтобы клетки стромы придавали резистентность опухолевым клеткам (рис. 8.1; Вилсон, неопубликованные данные). Аналогичные результаты были получены для веществ, относящихся к антибиотикам, антимитотическим агентам, алкилирую-щим агентам и антиметаболитам.
Метод культуры ткани наиболее перспективен в изучении необходимой продолжительности воздействия лекарства и восстановления клеток и в разработке методов количественной оценки действия лекарств. Монослойная культура требует наименьшего количества клеток и незаменима, следовательно, при создании микрометодов, обеспечивающих множественный скрининг лекарств в широком диапазоне концентраций. Кроме того, использование этого метода облегчает автоматизацию испытаний. Если количество клеток на самом деле слишком мало, то часто бывает возможным культивировать клетки до тех пор, пока не получится достаточное для анализа количество, несмотря на то, что данные об изменении чувствительности клеток к препаратам в ходе культивирования оказываются противоречивыми. Как правило, два — три пассажа клеток не влияют па чувствительность, и такое пассирование даже рекомендуется, поскольку приводит к снижению вариабельности результатов между параллельными культурами [18]. Если примесь клеток стромы очень высока, то пассирование клеток часто представляет возможность «очистить» опухолевые клетки путем дифференциальной ферментативной обработки или физического отбора клеток (см. гл. 5 и 6).
