Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
около 175 нм. Предположительно считают, что это п - а*-переход.
ПОГЛОЩЕНИЕ БЕЛКОВ В БЛИЖНЕЙ УФ-ОБЛАСТИ ОБУСЛОВЛЕНО АРОМАТИЧЕСКИМИ
АМИНОКИСЛОТАМИ
Для боковых групп некоторых аминокислот, таких, как Asp, Glu, Asn, Gin,
Arg и His, наблюдаются электронные переходы с энергией, лежащей в той же
области, что и энергия переходов, обусловливающих сильное поглощение
пептидной группы. Зарегистрировать эти переходы в белках или полипептидах
почти невозможно, поскольку оии уступают по интенсивности тг - г*-
переходу пептидной группы и к тому же число соответствующих боковых групп
обычно меньше, чем число пептидных групп. Таким образом, наиболее
информативными оптическими свойствами боковых групп являются те, которые
проявляются при длинах волн, превышающих 230 нм, где вклад в поглощение
пептидных групп становится пренебрежимо малым. В интервале от 230 до 300
нм, в ближней УФ-области, лежат полосы поглощения ароматических
аминокислот, Phe, Туг и Тгр, а также двух других боковых цепей -
гистидиновой и дисульфидного мостика (цистина). Спектры поглощения этих
трех ароматических аминокислот при нейтральных pH представлены на рис.
7.10. Использование логарифмической шкалы обусловлено большими различиями
в экстинкции. Поглощение триптофана значительно сильнее, чем двух других
аминокислот. Однако он редко присутствует в белках в больших количествах,
поэтому вклад тирозина в поглощение белка также оказывается весьма
значительным. етах фенилаланина гораздо
L, нм
СПЕКТРОСКОПИЯ ПОГЛОЩЕНИЯ
35
РИС. 7.10. Спектры поглощения трех ароматических аминокислот. Чтобы
изобразить все три кривые на одном рисунке, использована логарифмическая
шкала. [D.B. Wetlaufer, Adv. Protein Chem., 17, 303 (1962).]
X, нм
меньше - всего около 200 М ~1 - см -1 при 250 нм. По этой причине
обнаружить его присутствие в белках, содержащих другие ароматические
аминокислоты, оптическими методами почти невозможно. Поглощение
фенилаланина при 250 нм обусловлено запрещенным по симметрии тг - 7г*-
переходом; ту же природу имеет полоса при 256 нм в бензоле (етах = 400).
В тирозине локальная симметрия оказывается значительно ниже, а
наблюдаемый при 274 нм переход - значительно интенсивнее (етах ~ 1400);
аналогичный переход наблюдается в молекуле фенола при 271 им (етах =
2000). Спектр индоль-ной боковой группы триптофана имеет сложную природу;
в достаточно узком интервале длин волн - от 240 до 290 нм - располагаются
три или более электронных перехода (подробнее см. Weinryb, Steiner,
1971).
Изменение pH мало влияет на спектры поглощения изолированных пептидных
хромофоров. В противоположность этому тирозин и триптофан весьма
чувствительны к pH, так как места протонирования этих молекул
непосредственно связаны с системой электронного сопряжения хромофоров.
Наиболее ярко это проявляется в спектральном сдвиге у тирозина, когда
отщепляется протон ОН-группы (рАГа = 10,9) (см. рис. 7.11). Этот сдвиг
можно весьма точно зарегистрировать, просто измеряя поглощение при 295
нм. Снимая разностные спектры при этой длине волны, можно с высокой
точностью следить за титрованием остатков тирозина в белках. Влияние pH
на поглощение триптофана не столь существенно, чтобы использовать его для
аналогичных измерений. К тому же значения рЛТа триптофана лежат вне
области значений pH, при которых большинство белков сохраняет свою
нативность.
Измерение поглощения цистеинов в белках затруднено тем, что наиболее
длинноволновый интенсивный переход (Хтах = 230 нм) приходится на область
поглощения пептидной группы. Полосы поглощения дисульфидных мостиков
(цистинов) лежат в более длинноволновой области, с Хтах около 250 и 270
нм, но их интенсивность слишком мала
(? = 300), чтобы заметно сказываться на поглощении белка. Тем не менее
вклад этих переходов в оптическую активность белков весьма ощутим.
Поскольку некоторые из упомянутых боковых групп поглощают в той же
области, что и пептидные группы, их присутсвие иногда затрудняет
спектральные исследования белков. Когда белок содержит лишь несколько
сильно поглощающих остатков, становятся возможными однозначная
идентификация и анализ различных компонентов спектра. Наличие большого
количества ароматических остатков затрудняет подразделение спектра
36
ГЛАВА 7
РИС. 7.11. Спектрофотометрическое титрование панкреатической РНКазы быка.
А. Изменение спектра поглощения с изменением pH и со временем (при pH
12,2). При меньших значениях pH зависимость от времени отсутствует. Б.
Зависимость коэффициента экстинкции при 295 нм от pH. Участки,
изображенные сплошной линией, отвечают данным, не зависящим от времени.
РНКаза содержит шесть тирозиновых остатков. Представленные результаты
показывают, что три из них титруются обратимо , причем их рравно 10,2,
т.е. обычному значению. Три других не титруются и при более высоких pH,
вплоть до денатурации белка, что приводит к гистерезису, наблюдаемому при
обратном титровании. О - прямое титрование; О - обратное титрование после
