Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
приходящейся на одно звено, по меньшей мере в 102 раз, что позволяет
избежать ошибки.
Поскольку нас интересует спектр макромолекул, а не растворителя, на
практике, как правило, измеряют разность поглощений раствора макромолекул
и чистого растворителя. Чаще всего для этой цели используют двухлучевой
спектрофотометр, автоматически регистрирующий эту разность. Свет,
прошедший через образец, имеет интенсивность /обр, которая, согласно
уравнению (7.34), определяется из равенства
lg/o6p= lg/0- Аобр (7.35)
Аналогично интенсивность света, прошедшего через кювету сравнения, можно
найти из равенства
lg/cp= lg/"- Аср (7.36)
Следовательно, прибор, регистрирующий величину lg(/cp//o6p), измеряет
разность
•^обр Аср.
Эта же идея лежит в основе метода разностной спектроскопии. Предположим,
что нам нужно измерить с высокой точностью небольшие спектральные
изменения системы, происходящие, например, при добавлении субстрата к
ферменту. Если на пути одного пучка света двухлучевого прибора
поместить смесь субстрата и фермента, а на пути
другого - два исходных раствора фермента (Е) и субстрата (S),
то регистрируемый
спектр будет представлять собой разность, обусловленную взаимодействием
двух ве-
СПЕКТРОСКОПИЯ ПОГЛОЩЕНИЯ
25
ществ при образовании фермент-субстратного комплекса. На рис. 7.3., Б
изображена схема такого эксперимента с использованием четырех кювет для
образцов, каждая из которых имеет длину оптического пути I. При этом
измеряется величина
1) = Аг - А2 = 2[(ееСе + ?sCs) - (еЕСЕ + ?SCS + ?EsCes)]/
где штрихом отмечены концентрации веществ в кюветах, содержащих как Е,
так и S.
Дополнение 7.2 КОЭФФИЦИЕНТ ЭКСТИНКЦИИ И СЕЧЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ
Получим соотношение между коэффициентом экстинкции и размерами молекул.
Рассмотрим слой раствора плошади А (в см2) и толщины dl. Пусть молярная
концентрация растворенного вещества равна С; тогда число молекул этого
вещества в 1 см3 составит СА'(|/1000, а их число в слое dl будет равно
CAN0dl/1000. Если молекула растворенного вещества имеет радиус г, то
часть площади поперечного сечения, занимаемая в слое растворенными
молекулами, составит
/max = (nr2CAN0dl' 1000)/Adi = 71Г2СЛ'о 1000
Если бы каждая молекула поглощала весь падающий на нее свет,
эффективность поглощения света была бы максимальной и доля поглощенного
света равнялась бы/тах, как это изображено на рисунке. Таким образом,
приведенное равенство и было бы искомым соотношением между поглощением и
размерами молекул.
Если же молекулы не являются абсолютными поглотителями, следует ввести
вероятность Р того, что падающий на молекулу свет будет поглощен. Тогда
доля поглощенного света составит Pf ' . Вклад каждой отдельной молекулы
будет равен
а = Рпг2
Величину о называют сечением поглощения молекулы. Таким образом, доля
поглощенного света dl/l = (oCN0/WOO)dl. Сопоставляя приведенные здесь
равенства с уравнениями (7.32) - (7.34), нетрудно получить, что
е = (ffCNo/1000)/2,303C = aNJ2,303 = nr2 PN 0/2,303
26
ГЛАВА 7
Радиус типичного ароматического кольца лишь ненамного превосходит 1 А.
Поэтому мы можем оценить максимально возможный для вешеств этого класса
коэффициент экстинкции как величину порядка 105М-1 ¦ см _I. В
действительности даже для сильно поглощающих веществ ? = 104М~1 • см-Это
означает, что поглощается лишь 10% падающего на хромофор света. (В основе
приведенных здесь рассуждений лежат заметки, предоставленные Робертом
Дженнисом.)
СВЯЗЬ МЕЖДУ КОЭФФИЦИЕНТОМ экстинкции И НЕКОТОРЫМИ МОЛЕКУЛЯРНЫМИ
СВОЙСТВАМИ
Молярный коэффициент экстинкции определяется эмпирически при помощи
уравнения (7.32). Чтобы связать его с молекулярными характеристиками,
вернемся к уравнению
(7.30). Обычно число возбужденных молекул в образце (Nb) пренебрежимо
мало. Следо-
вательно, для одномолярного раствора поглощающих молекул скорость
поглощения энергии в 1 см 3 образца равна
- dl(v)/dt = (hvN0Bab/mO)I(v) (7.37)
где v - частота возбуждающего света, N0 - число Авогадро. Так как свет
распространяется со скоростью с, уменьшение его интенсивности на
расстоянии dl равно
dl(v) = (1 lc)[dl(\)ldt] dl = (hvN0Bab/lOOOc)I(v) dl (7.38)
Сравнивая уравнение (7.32) и (7.38), можно найти для одномолярного
раствора соотношение между величинами ВаЬ и е'. На первый взгляд кажется,
что ВаЬ = 1000 e'c/N0hp. Однако, поскольку наблюдаемые полосы поглощения
достаточно широки, а величина ВаЬ определена для двух состояний, разность
энергий которых характеризуется вполне определенной частотой (г), для
вычисления Bob необходимо проинтегрировать е' по всему интервалу частот,
на который простирается данная полоса (Birks, 1970, р. 48-50):
Bab = (\00Oc/Noh) J (e'/v) dv (7.39)
Поскольку интегрирование производится по частоте, то спектр,
представленный как зависимость е' от длины волны, необходимо
преобразовать к виду е' = f(v).
Важный молекулярный параметр, который может быть получен с помощью
величины - это I < I /а I ?с) I 2. Используя уравнения (7.29) и
