Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
группы), так что оптическая плотность белкового раствора с концентрацией
1 мг • мл _ 1 составит А 230 = 3. Однако многие из используемых
растворителей также поглощают при этой длине волны, что существенно
усложняет определение концентрации.
ПОГЛОЩЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ОСНОВАНИЯМИ
Интенсивное поглощение всех нуклеиновых кислот в ближней УФ-области почти
целиком обязано пуриновым и пиримидиновым основаниям. Сахарофосфатный
остов РНК и ДНК дает незначительный вклад в спектр поглощения при длинах
волн, превышающих 200 нм. Несмотря на это свободные основания не могут
служить совершенными моделями хромофоров нуклеиновых кислот. Отсутствие
гликозидной С-N-связи вызывает значительное возмущение электронных
состояний. Например, свободные пурины могут претерпевать таутомерные
превращения вследствие перемещения протона между атомами азота в
положениях 9 и 7. Более приемлемыми модельными соединениями являются №-
мети л пурины и N '-метилпиримидины. Спектры этих веществ весьма близки к
спектрам нуклеозидов.
Спектры четырех нуклеозидов в воде при pH 7 выглядят обманчиво просто
(рис. 7.12). Однако электронная структура пуринов и пиримидинов гораздо
сложнее, чем белковых хромофорных групп. Основания имеют очень низкую
симметрию и много несвязывающих электронов. Сопоставление со спектрами
ряда более простых молекул показывает, что у всех оснований в области от
200 до 300 нм должно проявляться несколько разных п - 7г*-и 7г - 7г*-
переходов. Кажущиеся простыми полосы поглощения аденина и ураци-ла с Хтах
= 260 нм, имеющие вид гауссовых кривых, в действительности порождаются
более чем одним переходом. G и С, имеющие на первый взгляд лишь по две
полосы, на самом деле, вероятно, обладают большим числом невыявленных
полос.
Моменты переходов многих электронных полос оснований нуклеиновых кислот
лежат в плоскости ароматических колец. Их направления, полученные
теоретически или экспериментально, показаны на рис. 7.13. Ясно, что
поглощение всех оснований в ближней
СПЕКТРОСКОПИЯ ПОГЛОЩЕНИЯ
39
Х,нм
180 200 220 240 260 280 300
А, нм
РИС. 7.12. Спектры поглощения четырех дезоксинуклеотидов как функция pH.
Спектры рибонукле-отидов весьма близки к ним, за исключением спектра
уридина (U), у которого Хп|ах = 260, а не 268нм, как для dT. [D.Voet,
W.B.Gratzer, R.A.Cox, P.Doty, Biopolymers, 1, 193 (1963).]
(260)
Вычисленный
-> 240,207
(260)
Наблюдаемый
(275
(240)
Вычисленный
JS
240
Наблюдаемый
(200) H (267)^
'(230) Вычисленный 267(^230
Наблюдаемый
*(210) (258,230) Вычисленный
210
258' Наблюдаемый
РИС. 7.13. Теоретические и наблюдаемые направления моментов переходов в
N-алкилированных основаниях нуклеиновых кислот. [V.Bloomfield,
D.Crothers, l.Tinoco, Jr., Physical Chemistry of Nucleic Acids, New York,
Harper and Row, 1975, p.50.)
УФ-области обусловлено несколькими переходами. Это сильно усложняет
анализ влияния конформации на спектры нуклеиновых кислот.
40
ГЛАВА 7
Спектры всех четырех нуклеозидов чувствительны к pH. Протонирование С и G
приводит к значительному сдвигу поглощения в сторону бблыпих длин волн
(красное смещение). Депротонирование U или Т при щелочных pH также
приводит к существенному красному смещению максимума поглощения.
Протонирование А сопровождается гораздо меньшими, но вполне поддающимися
регистрации спектральными изменениями. Все эти эффекты весьма полезны для
определения степени ионизации отдельных составляющих нуклеиновых кислот,
однако в полимерах они становятся более сложными из-за сильного
электронного взаимодействия между основаниями. Позже мы обсудим эту
проблему. Присутствие фосфатных групп, по-видимому, не сказывается
сколько-нибудь заметно на молярной экстинкции различных составляющих
нуклеиновых кислот. Например, значения Хтах и ?тах для ATP, ADP, АМР,
аденозина и 3' - или 2' -адениловой кислоты оказываются в пределах ошибки
эксперимента одинаковыми.
Энергия длинноволновых, достаточно интенсивных электронных переходов пяти
наиболее распространенных оснований почти одинакова. Это служит серьезным
препятствием для детального анализа электронных спектров ДНК и РНК.
Полосы поглощения отдельных хромофоров типичной нуклеиновой кислоты
сливаются и дают простую на вид полосу с Хтах = 260 нм (рис. 7.14).
Свойства отдельных оснований оказываются весьма близкими, так что даже в
отсутствие достаточно сильного взаимодействия между основаниями трудно
представить полосу поглощения с Хтах = 260 нм для нуклеиновой кислоты в
виде суммы четырех составляющих с определенными весами.
Средний коэффициент молярной экстинкции при 260 нм в расчете на моль
нуклеозидов примерно равен 1,0 ¦ 104. Следовательно, для получения
хорошей точности при регистрации спектров поглощения нуклеиновых кислот в
УФ-области концентрация последних
X, нм
РИС. 7.14. Спектр поглощения ДНК как функция температуры. После
расщепления ДНК ферментами в растворе должны присутствовать только
мононуклеотиды и. возможно, небольшое количество коротких олигомеров.
