Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
интенсивность очень мала и составляет примерно 1 % интенсивности типичной
ж - 7г*-полосы. Пример такого рода приведен на рис. 7.8.
7.3. Спектроскопия биополимеров
СПЕКТРАЛЬНАЯ ОБЛАСТЬ, В КОТОРОЙ ПРОВОДЯТСЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ
Любая молекула поглощает свет в достаточно широкой области длин волн.
Однако при данной длине волны в спектре обычно преобладает поглощение
химических групп лишь одного типа. Эти группы называются хромофорами.
Хромофоры, входящие в состав белков и нуклеиновых кислот, поглощают свет
только при длинах волн, меньших чем 300 нм. Эти группировки, такие, как
пептидные группы или основания нуклеиновых кислот, значительно сложнее
молекулы формальдегида. Подробное обсуждение их электронной структуры
выходит за рамки этой книги, и мы лишь перечислим те их свойства, которые
облегчают или, напротив, усложняют спектральные исследования белков и
нуклеиновых кислот.
Одно из главных ограничений спектроскопии биополимеров состоит в
необходимости работать с растворами. Очевидно, что изучение таких больших
молекул в газовой фазе не-
СПЕКТРОСКОПИЯ ПОГЛОЩЕНИЯ
33
возможно. Спектральные исследования в твердой фазе осложняются
дихроичными эффектами, а также трудностями, связанными с соотнесением
молекулярных свойств, полученных при исследовании в твердом состоянии, со
свойствами этих же молекул в растворе, где обычно проводятся
биологические исследования. Для подавляющего большинства белков и
нуклеиновых кислот наиболее пригодными для имитации условий in vivo
растворителями являются водные буферные растворы при pH = 7,0, содержащие
достаточные количества электролитов (например, - 0,15 М NaCl).
Использование воды в качестве растворителя автоматически ограничивает
спектральные измерения областью длин волн, больших чем 170 нм. Ниже этого
предельного значения поглощение даже очень тонких (- 1 мкм) водных пленок
столь велико, что регистрация на его фоне какого бы то ни было вклада от
макромолекул требует высокой точности Из-за того что вода обладает
высокой полярностью, электронные полосы поглощения в водных растворах
оказываются заметно шире, чем для большинства других растворителей.
Энергия отдельных молекул различается, поскольку сильное взаимодействие
их с молекулами растворителя меняется в зависимости от конфигурации
окружения. Это приводит к тому, что колебательная структура электронных
полос практически не проявляется. Другая трудность связана с узостью
температурного интервала, в котором вода существует в жидком состоянии.
Для белков и нуклеиновых кислот это не столь важно, однако в случае
многих модельных соединений невозможность проводить измерения ниже 0°С и
выше 100°С оказывается подчас весьма огорчающим обстоятельством.
ПОГЛОЩЕНИЕ БЕЛКОВ В ДАЛЬНЕЙ УФ-ОБЛАСТИ ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ПЕПТИДНЫМИ ГРУППАМИ
Хромофоры белковых молекул удобно разделить на три класса: собственно
пептидные группы, боковые группы аминокислотных остатков и прастетические
группы. Для изучения свойств пептидных хромофоров можно использовать
модельные соединения, такие, как формамид или N-метилацетамид:
О О
Некоторые аспекты электронной структуры пептидной группы обсуждались в
гл. 5. ж-Электроны этой группы в известной мере делокализованы по трем
атомам: азоту, углероду и кислороду. Среди наблюдаемых в пептидной группе
переходов наименьшей энергией обладает п - 7г*-переход. Как и в случае
формальдегида, n-электрон локализован на атоме кислорода, и этот переход
запрещен по симметрии.
п - 7г*-Полоса поглощения в пептидах обычно наблюдается при 210-220 нм и
является очень слабой (етах * 100). В качестве примера на рис. 7.9.
приведены спектры поглощения разных структурных форм поли-Ь-лизина. В
случае а-спиральной конформации полимера п - 7Г*-переход проявляется в
виде небольшого плеча с X * 220 нм на фоне гораздо более сильной полосы с
максимумом вблизи 190 им. Эта интенсивная полоса, главная в доступной для
измерений области, порождается ж - ж '-переходом (етах * 7000). В
молекуле формальдегида этот самый низкоэнергетический ж - 7г*-переход
поляризован вдоль С = 0-связи. Поскольку электроны атома азота,
находящегося в составе пептидной
11 Для измерения при X < 200 нм необходимо позаботиться о выборе
прозрачных в этой области солей и буферов. Наиболее пригодными для этих
целей являются соли хлорной и плавиковой кислот (перхлораты и фториды).
3-84
34
ГЛАВА 7
РИС. 7.9. Спектр поглощения поли-L-ли зина в водном растворе. / -
беспорядочный клубок, pH 6,0, 25°С. II - ач'нн-раль, pH 10,8, 25°С. Ill -
0-слой, pH 10,8, 52°С. [К. Rosenheck, P. Doly, Ргос. Natl. Acad. Sci.
USA, 47, 1775 (1961).]
группы, принимают участие в образовании п^и 7г*-орбиталей, момент тг -
7г*-перехода уже не направлен вдоль какой-либо определенной связи. В
миристамиде он лежит в плоскости пептидной группы вблизи линии,
соединяющей атомы кислорода и азота:
\
\
гК-
с V н
/ N СН3- (СН2),/ |\
н\
\
\
ч
\
При еще более высоких энергиях можно наблюдать третий переход с Хтах
