Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
Обратите внимание, что спектр, измеренный при высокой температуре, очень
близок к спектру препарата, обработанного ферментами. I - нативная ДНК,
25°С; II - препарат, обработанный ферментами; III - ДНК E.coli, 82°С.
[D.Voet, W.B.Gratzer, R.A.Cox, P.Doty, Biopolymers, 1, 193 (1963).]
СПЕКТРОСКОПИЯ ПОГЛОЩЕНИЯ
41
должна быть порядка 3 мкг • мл ~1. Такая весьма высокая чувствительность
позволяет использовать измерение УФ-поглощения во множестве аналитических
методов. Необычные основания, присутствующие в тРНК в малом количестве,
обладают длинноволновыми переходами, заметно смещенными в красную область
по сравнению с обычными основаниями нуклеиновых кислот: это основания Y
(Хтах = 325 нм) и 4-тиоуридин (Хтах = 340 нм). Поскольку обычные
основания практически не поглощают при этих длинах волн, минорные
основания можно изучать независимо, производя измерения при X > 300 нм.
Однако и здесь Природа оказалась не слишком великодушной, так как
коэффициенты экстинкции этих оснований невелики, а их содержание (если
они вообще присутствуют в данной молекуле) обычно в 80 раз меньше, чем
обычных оснований в тРНК. Таким образом, для точных измерений при X > 300
нм необходимо иметь образцы с гораздо более высокой концентрацией.
Взаимодействия между белками и нуклеиновыми кислотами имеют огромное
биологическое значение. Поэтому изучение физических аспектов этих
взаимодействий представляет очень большой интерес, и применение
абсорбционной спектроскопии может в принципе оказаться здесь весьма
полезным. Однако все сказанное выше свидетельствует о сложности
одновременного исследования белков и нуклеиновых кислот в смеси.
Рассмотрим взаимодействие между тРНК с мол. массой 25 000 (е 260 - 560
000) и аминоацил-тРНК-синтетазой с мол. массой 100 000 (?280 ~ '00 000).
Несмотря на четырехкратное превосходство синтетаэы по массе, спектр
поглощения в ближней УФ-области будет определяться в основном тРНК. И
хотя отношение А 280 /4 260 позволяет судить об относительных количествах
белка и нуклеиновой кислоты, более детальный анализ спектра с целью
выявления их индивидуальных свойств очень сложен, так как полосы
поглощения белка сильно перекрываются с более интенсивными полосами
поглощения тРНК.
7.4. Влияние конформации на поглощение
Как сказывается на оптических свойствах хромофоров белка или нуклеиновой
кислоты то, что они являются частью полимера? К чему приводит воздействие
на них со стороны других звеньев полимерной цепи? Для простоты рассмотрим
полимер с регулярной структурой, например спиральной, где все звенья
имеют одинаковое окружение. Сравним спектр поглощения двойной спирали ДНК
со спектром, ожидаемым для смеси ее мономерных составляющих. Последний
может быть представлен как С/? xfj- сумма взве-
i
шенных спектров мономеров, где х,- - мольная доля остатка /-го типа, С -
суммарная концентрация мономерных остатков, а ?(- - известная молярная
экстинкция чистого мономера /-го типа. Однако проще расщепить ДНК на
смесь мономеров при помоши ферментов. Спектр получающейся при этом смеси,
а также спектр нативной двухцепочечной ДНК в В-форме приведены на рис.
7.14. Несмотря на качественное сходство, спектры заметно различаются в
количественном отношении. Эти различия могли возникнуть из-за того, что
полимер обладает определенной конформацией, или из-за образования между
мономерами ковалентных связей. Если разрушить двойную спираль путем
нагревания до 90°С, то мы получим спектр (также показанный на рис. 7.14),
весьма близкий к спектру мономеров. Для строгости сравнения следовало бы,
конечно, снять и спектр мономеров при 90°С, однако поглощение свободных
мономеров фактически не зависит от температуры. Обычно отличие спектра
поглощения полимера от спектра его простых мономерных единиц определяется
главным образом конформацией полимера. В случае полипептидов мономерным
звеном следует считать пептидную группу, поскольку свободные аминокислоты
не имеют пептидного хромофора.
Оптические свойства хромофоров могут изменяться при образовании
полимерной структуры по нескольким причинам. Геометрия хромофора может
искажаться из-за силь-
42
ГЛАВА 7
ного взаимодействия с другими группами. Такие примеры известны, но они
крайне редки, и мы не будем их рассматривать Все остальные возможности
относятся к разряду более слабых взаимодействий. Свойства хромофоров
могут меняться в зависимости от локального окружения или от
взаимодействия его с соседними хромофорами. Рассмотрим сначала обычный
эффект окружения. Это может быть влияние и локального pH, и
диэлектрической проницаемости, и жесткости среды, и наличия соседних
групп, способных вступать в специфические химические взаимодействия
(такие, как перенос заряда или протона, связывание с ионом металла). Мы
остановимся здесь только на влиянии полярности растворителя.
ВЛИЯНИЕ НА СПЕКТРЫ ЛОКАЛЬНОГО ОКРУЖЕНИЯ ХРОМОФОРОВ
Спектры многих хромофоров зависят от растворителя. Эта зависимость может
