Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
достижения pH 11,5; в-обратное титрование после достижения pH 12,7.
[C.Tanford, J.D.Hauenstein, D.G.Rands, J.Am. Chem. Soc., 77, 6409
(1955).]
вблизи 200 нм на отдельные составляющие, которые отвечали бы боковым
группам и пептидному остову.
ВЛИЯНИЕ ПРОСТЕТИЧЕСКИХ ГРУПП
Наличие в том или ином белке простетической группы создает те же
проблемы, что и присутствие ароматических аминокислот. Например, гемы,
флавины, пиридоксальфос-фат и некоторые металлопротеиды обладают
интенсивными полосами поглощения в ближней УФ- и видимой областях. По
этим полосам, обычно весьма чувствительным к ближайшему окружению
простетических групп, можно с успехом следить за их состоянием, например
за окислением или оксигенацией. При исследовании многих ферментативных
процессов физическими методами наличие таких удобно расположенных
хромофоров подчас оказывается просто необходимым.
Однако присутствие в белках простетических групп создает и определенные
трудности. Почти все хромофоры, которые поглощают в ближней УФ- или
видимой областях, име-
СПЕКТРОСКОПИЯ ПОГЛОЩЕНИЯ
37
ют столь же интенсивные переходы в интервале от 200 до 300 нм. Если такие
хромофоры содержатся в белке в большом количестве, они могут сильно
мешать исследованию собственно полипептида. Обойти эту трудность можно,
используя апобелки, лишенные про-стетической группы. Однако при этом
исследователь обязан убедиться, что подобная процедура не искажает
сколько-нибудь заметно структуру полипептидной цепи. Для этого редко
бывает достаточно прямых оптических измерений. Если сумма спектров
изолированной простетической группы и апобелка совпадает со спектром
нативного холобелка, это несколько обнадеживает. Однако, как правило,
подобной аддитивности не наблюдается. Даже в отсутствие конформационных
изменений спектры как простетической группы, так и белка изменяются под
действием электронных взаимодействий.
Наличие простетической группы оказывается полезным лишь при условии, что
она обладает достаточно большим коэффициентом молярной экстинкции, дабы
быть заметной при типичных концентрациях белка. Последние во избежание
агрегации должны быть меньше2,5 мг ¦ мл ~!. Еслипростетические группы
обладают cmax = 103 - 104, тотем самым обеспечивается более чем
достаточная экспериментальная чувствительность в широком диапазоне
концентраций. В табл. 7.2 кратко суммированы спектральные свойства
некоторых белков, содержащих наиболее распространенные простетические
группы.
Таблица 7.2
СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ,
СОДЕРЖАЩИХ ПРОСТЕТИЧЕСКИЕ ГРУППЫ
Белок Простетическая группа Первая н вторая наиболее длинноволновые
полосы поглощения
^тах' СшахХ \пах* Сшахх нм нм х 10"4
Оксидаза аминокислот из Флавинмононуклеотид 455 1,27 358 1,07
почек крысы
Азурин из P. fluorescens Си (II) 781 0,32 625 0,35
Церулоплазмин человека 8Си (3 различных типа) 794 2,2 610 1,13
Восстановленный цитохром с Fe (П)-гем 550 2,77 - -
человека
Ферредоксин из Scenedesmus [2Fe (III)-2S]-iuiacTep 421 0,98 330
1,33
Флаводоксин из С. pasteunanium Флавинмононуклеотид 443 0,91 372
0,79
Моиоаминоксидаза из почек Флавины +Си 445 4,7
быка
Пируватдегидрогеназа Флавинадениндинуклеотид 460 1,27 438 1,46
из E.coli
Родопсин быка Ретиналь-Lys 498 4,2 350 1,1
Рубредоксин из M.aerogenes [Fe (III)-4Cys]-тетраэдр 570 0,35 490
0,76
Треониндезаминаза из Е.соЧ 4 пиридоксальфосфата 415 2,6 - -
Ксантиноксидаза Fe, Мо . 550 2,2 - -
38
ГЛАВА 7
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА ИЗ ДАННЫХ ПО УФ-ПОГЛОЩЕНИЮ
Типичный белок, не содержащий простетических групп, имеет максимум
поглощения в ближней УФ-области при X_av = 280 нм. Коэффициенты
экстинкции триптофана и тиро-
I __ |
зина при этой длине волны составляют приблизительно 5700 и 1300 М • см
соответственно. В первом приближении можно считать, что экстинкция этих
аминокислот не претерпевает значительных изменений при их включении в
белковую цепь. Поскольку никакие другие остатки ие дают заметного вклада
в поглощение при 280 нм, коэффициент экстинкции белка можно определить,
зная число остатков тирбзина (лТуг) и триптофана ("тгр)- Оптическая
плотность раствора с концентрацией 1 мг • мл _1 и толщиной 1 см равна
(5700 лТгр + 1300 лТуг)/А/, где М - молекулярная масса. Вычисленная таким
способом оптическая плотность 14 выбранных наугад белков составила 1,1 ±
0,5. Таким образом, предполагая, что раствор любого белка с концентрацией
1 мг • мл ~1 обладает оптической плотностью 1,0, можно, рискуя вдвое
ошибиться, определить весовую концентрацию белка, измеряя его поглощение
при 280 нм. Этот метод не приводит к разрушению образца, однако по своей
чувствительности почти на порядок уступает колориметрическому тесту
Лоури. Чувствительность прямых измерений поглощения можно увеличить,
перейдя к длине волны 230 нм. Все остатки обладают в этой области
молярной экстинкцией, примерно равной 300 (среднее от вклада, даваемого
перекрывающимися полосами для боковых цепей и 7г - ж*-полосы пептидной
