Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
применялись для разделения производных прегнана методом ВЭЖХ [51-62].
Подходящими органическими модификаторами подвижной фазы являются такие
спирты, как метанол и 2-пропанол, а также ацетонитрил и тетрагидро-фуран.
В фундаментальном исследовании О'Хары и сотр. [63] определено время
удерживания кортикостероидов и многих других стероидов при разделении на
обращенной фазе (зорбакс ODS) с использованием различных подвижных фаз
(табл. 11.12, рис. 11.18-11.20).
11.6. Определение стероидных гормонов в биологических жидкостях
Определению стероидных гормонов в биологических жидкостях методом ВЭЖХ
посвящено очень большое число работ (см., например, определение
кортикостероидов [64-71], тестостерона
[72], эстрогенных гормонов [25, 27, 73]). В этих целях применяются
колонки с такими обращенными фазами, как Sil-X-RP [64], гиперсил ODS
[66], RP-8 [70, 76], ji-бондапак Cig [72,73], партисил-10 ODS [27],
лихросорб С2 [73], лихросорб RP-18
[73], а также силикагели [25, 27, 65, 67, 69, 70, 74, 75] или си-
Поглощение Поглощеиие
-1. мин
Рис. 11.19. Разделение тестикулярных 5^ стероидов методом ВЭЖХ
[63].
ГЗГ Колонка: 250X2,1 мм (йнутр. диаметр);
^ неподвижная фаза: зорбакс ODS; элюент:
g градиентное элюирование, начиная со сме*
сн адетонитрнл/вода (8 : 25) до 100% аде-тоннтрила в течение 50 мин;
объемная скорость: 0,38 (в начале) и 0,80 мл/мнн (в конце); обнаружение:
при 240 нм; проба: от 330 до 750 мкг каждого стероида.
/ - прогестерон; 2 - 20а-дигндропрогесте-рон; 3 - 5а-
днгндротестостерон; 4 - дегнд-роэпнандростерон; 5- 17а-гидрокснпроге*
стерон; 6 - андростенднон; 7 - тестостерон; 8- 17а-гндроксн-20а-
дигидропрогесте-рон; 9-16а-гндрокснпрогестерои; /0 - 7а-
гидрокснтестостерон.
10
60
40 32 24
16 + мин
40
20
Рис. 11.20. Разделение полярных стероидов коры надпочечников методом
ВЭЖХ [63].
Колонка: 250X2,1 мм (внугр. диаметр); неподвижная фаза: зорбакс ODS;
элюент: градиентное элюирование, начиная со смеси диоксан/вода (1:4) н
заканчивая диок" саном (100%) в течение 50 мин; объемная скорость: 0,38
(в начале) и 0,34 мл/мнн (в конце); обнаружение: при 254 им; проба: от
250 до 750 мкг каждого стероида.
/ - кортнкостерон; 2- 18-гидрокси-1Ьдез* окснкортнкостерон; 3- 11(5-
гндрокснандро-стенднои; 4 - кортизол; 5 - кортизон; lS-
гндрокснкортикостерон; 7 - альдосте* рои; 8 - 18-гн дрокси-11 -
дегндрокортикосте-рон; 9-11-дегндроальдостерон; 10 - бр'ГНдроксикортнзол.
556 Глава 11
Плазма
Отмывка:
1X20 объемов изооктана (при 0 °С)
Экстракция:
2ХЮ объемов метиленхлорида
I
Отмывка:
1Х1/Ю объема 0,1 М раствора NaOH
2X1/10 объема дистиллированной воды
Высушивание над Na2S04 (безводным)
I
Упаривание (досуха)
Растворение в 15 мкл и отбор части пробы для ввода на
колонку
I
ЖХ
Рис. 11.21. Метод экстракции кортикостероидов [64].
ликагели, покрытые пленкой полярного соединения [68, 71, 73].
Прежде чем проводить анализ методом ВЭЖХ стероидов в биологических
жидкостях, производные пергидроциклопентано-фенантрена обычно
экстрагируют органическими растворителями, например метиленхлоридом [64,
67, 69, 76], диэтиловым эфиром [25, 27] и т. п. Выше показана типичная
методика экстракции, используемая при определении кортикостероидов в 5 мл
плазмы крови (рис. 11.21).
Концентрация эстрогенных стероидов в моче женщины в период
беременности - чрезвычайно важный показатель ее состояния. В настоящее
время разработаны способы определения эстрогенов в моче при помощи ВЭЖХ
[25, 27, 73]. На рис. 11.22 и 11.23 показаны хроматограммы экстрактов
мочи беременных женщин, полученные методом жидко-твердофазовой и
обращенно-фазовой ВЭЖХ; рассчитанные концентрации эстрогенов в моче
беременных и соответствующие им относительные стандартные отклонения даны
в табл. 11.13.
Стероидные гормоны 557
Рис. 11.22. Хроматограмма экстракта мочи беременной женщины (40 мл мочи
гидролизовали концентрированной соляной кислотой н экстрагировали
продукты гидролиза диэтиловым эфиром) [27].
Колонка: 150X4,9 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: партнснл 5 (7
мкм); подвижная фаза; этаиод/и-гекеан (5; 95); объемная скорость: 5
мл/мнн; обнаружение: при 280 нм.
ВЭЖХ также применима для количественного анализа 11-дезоксикортизола
и кортизола в плазме крови при метирапо-новом тесте [69]. Условия
определения 11-дезоксикортизола и кортизола в плазме крови приведены в
подписях к рис. 11.24 и 11.25. Подготовку пробы проводят следующим
образом. К 0,6 мл плазмы крови добавляют 0,05 мл раствора гидроксида
