Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
натрия в концентрации 3 моль/л и 100 нг преднизона или соответственно
преднизолона. Далее добавляют 4 мл дихлорметана, инкубируют 5 мин,
центрифугируют, отделяют слой органического растворителя и промывают его
1 М раствором соляной кислоты и водой. 3 мл экстракта упаривают досуха и
осадок растворяют в 50 мкл хлороформа. Для проведения разделения методом
ВЭЖХ используют пробу объемом 20 мкл (рис. 11.24 и 11.25).
Если разделение ведется на колонках, заполненных силикагелем с малым
размером частиц, а элюентом служит смесь ме-танол/метиленхлорид (3:97),
то за один хроматографический
Эстрадиол
Рис. 11.23. Хроматограмма экстракта мочи беременной женщины (40 мл мочи
гидролизовали концентрированной соляиой кислотой и экстрагировали
продукты гидролиза диэтиловым эфиром, эфир отгоняли досуха и осадок
растворяли в 1 мл смеси метанол/0,1 %-иый карбонат аммония (55 : 45) для
последующего разделения методом ВЭЖХ) [17].
Колонка: 250X4,6 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: партнсил 10 OD5
(10 мкм);
элюент: 0,1% метанол/0,1%-ный вод-
ный раствор карбоната аммония (55 : 45): объемная скорость: 2 мл/мнн;
обнаружение: при 280 ям.
t, МИН
t, МИН
Рис. 11.24. Полученные методом ВЭЖХ хроматограммы экстрактов плазмы до
(а) и после (б) введения метирапона (30 мг/кг массы тела, плазма взята
через 8 ч после введения метирапона, методику приготовления образцов
плазмы см. в тексте) [69].
Колонка: 250X3 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: SI-10 (10 мкм);
элюент: хлороформ/изооктаи/метаиол/вода (4,5 : 48,5:2.9:0.12); объемная
скорость: 65 мл/ч; обнаружение: при 254 им;
/ -прединзои (внутренний стандарт, см. текст); 2 - 11-дезоксикортнзол,
Рис. 11.25. Полученные методом ВЭЖХ хроматограммы экстрактов плазмы
до (а) и после (б) введения метирапона (30 мг/кг массы тела, плазма взята
через 8 ч после введения метирапоиа, методику приготовления образцов
плазмы см. в тексте) Г69].
Колонка: 250X3 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: SI-10 (10 мкм);
элюент: хлороформ/изооктан/метанол/вода (71 : 25 : : 3.75 : 0,25);
объемная скорость: 65 мл/ч; обнаружение: при 254 нм;
1 - преднизолон (внутренний стандарт, см. текст); 2-кортнзол.
0,005ед.(?огл
Рис. 11.26. Полученные методом ВЭЖХ хроматограммы экстрактов
плазмы до (а) и после (б) введения предиизоиа (плазма взята через 3 ч
после одноразового перорального введения 50 мг преднизона, методику
приготовления образцов плазмы см. в тексте) [67]. Колонка: 250X4,6 мм
(внутр. диаметр); неподвижная фаза: зорбакс SIL (5-6 мкм); элюеит:
метанол/ме-тилеихлорид (3 : 97); объемная скорость: 2 мл/мин;
обнаружение: при 254 им.
1 - прединзои; 2 - дексаметазон
(внутренний стандарт); 3 -кортнзол; 4 - преднизолон.
560 Глава 11
Таблица 11.13. Рассчитанные уровни эстрогенов в моче беременных ц
соответствующие им относительные стандартные отклонения (ОСО, см. рис.
11.22, 11.23) [27]
Соединение Концентрация в моче, г/л
партиснл 5 партиснл 10 ODS
Эстрон _ 7,3-10-3 (ОСО 18%)
Эстрадиол 1,8-10-3 (ОСО 18%) 2,5-10~3 (ОСО 18%)
Эстриол 3310-3 (ОСО 18%) 30-10-3 (ОСО 9%)
цикл в одной пробе экстракта плазмы крови методом ВЭЖХ можно определить
преднизон, дексаметазон, кортизол и предни-золон. Для приготовления пробы
1 мл биологической жидкости экстрагируют 10 мл метиленхлорида. Перед
разделением методом ВЭЖХ органический слой промывают раствором гидроксида
натрия и водой (рис. 11.26) [67].
11.7. Исследование лекарственных средств стероидного ряда методом ВЭЖХ
В последнее время метод ВЭЖХ стал одним из наиболее важных методов
анализа синтетических стероидных лекарственных средств. Например, на
колонках с силикагелем проведено успешное разделение преднизона и
преднизолона [75, 77], декса-метазона [77, 78] и ацетонида триамцинолона
[79]. В литературе имеются многочисленные сообщения об исследованиях
стероидных лекарственных средств методом ВЭЖХ на обращенных фазах (см.,
например, исследование преднизолона [80, 81], метилпреднизолона [45, 82],
ацетонида триамцинолона 83], ацетата флюдрокортизона [84], диацетата
этиндиола 85], 17-валерата бетаметазона, 17-пропионата клобетазона,
7-бутирата клобетазона, дипропионата беклометазона, 21-ди-натрийфосфата
бетаметазона, бетаметазона [86], будесонида и родственных
кортикостероидов [53], 21-дегидропреднизолона [87] или тестолактона
[88]).
В фундаментальной работе Хара и Хаяши [65] систематизированы
экспериментальные данные и выявлена зависимость между химической
структурой компонентов пробы и их характеристиками удерживания на
силикагелевых и обращенных фазах. Чтобы можно было сравнивать
характеристики удерживания всех стероидов, были вычислены относительные
объемы удерживания с использованием тестостерона в качестве стандарта.
Относительные объемы удерживания У#(А)т рассчитывались по уравнению
log Vх/?(А)т = log Vr(A)/Vr(7) (5)
