Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Малые коэффициенты емкости наблюдаются при разделении фосфатов эстрогенов
с использованием ионов магния в качестве катионов элюента, что указывает
на образование комплексов (табл. 11.6).
Рис. 11.11 показывает, как влияет величина pH элюента на коэффициенты
емкости конъюгатов эстрогенов при их разделении на целлюлозных
ионообменниках. Из приведенных данных можно сделать следующие выводы.
Конъюгаты эстрогенов элюируются в следующем порядке: глюкурониды,
фосфаты, сульфаты. При низких pH наблюдается более сильное удерживание.
Одинаковые конъюгаты элюируются в следующем порядке: эстриол, эстрон,
эстрадиол.
В принципе коэффициенты емкости конъюгатов эстрогенов при разделении
на колонках с целлюлозными ионообменниками уменьшаются с увеличением
температуры. Однако величина уменьшения колеблется от соединения к
соединению, как это показано на рис. 11.12 на примере сульфатов некоторых
эстрогенов.
Авторы работы [37] провели разделение конъюгатов эстрогенов на сильном
анионообменнике - тонкодисперсном силикагеле с химически привитыми ионами
четвертичного аммония (лихросорб AN, 10 мкм). Коэффициенты емкости
конъюгатов эстрогенов, полученные при их разделении на колонке с лихро-
сорбом AN с использованием различных подвижных фаз, указаны в табл. 11.7.
Как следует из приведенных в этой таблице данных, с уменьшением
концентрации метанола и увеличением pH элюента возрастает селективность в
ряду конъюгатов одного типа. При высоких pH элюента происходят изменения
в неподвижной фазе, лихросорбе AN, и наблюдается размывание пиков. По
сравнению с обращенно-фазовой хроматографией может значительно
увеличиваться дисперсия пиков.
Анионообменники с углеводородной матрицей - отличная неподвижная фаза
для разделения углеводов [38], кроме того, они также пригодны и для
разделения конъюгатов эстрогенов (табл. 11.8).
Тем не менее разделение конъюгатов эстрогенов на колонке1 с аминексом
А-28 требует больших затрат времени (рис. 11.13) [37]. При разделении
конъюгатов эстрогенов на анионообмен* никах с развитой поверхностью
(зипакс SAX) и поверхностно* пористых анионообменниках (AL пеллионекс
WAX) эффектив-
542
Глава 11
6,0 7,0
pH -
Рис. 11.11. Влияние величины pH элю-ента на коэффициент емкости k для
конъюгатов эстрогенов [33].
Колонка: 250X3 мм (внутр, диаметр); неподвижная фаза: ECTEOLA-
целлюлоза
В 300 (19 мкм); элюент: 0,025 моль/л пер-хлората+0,01 моль/л фосфата;
обнаружение: при 220 нм; температура: 70 °С;
/ - З-Р-О-глюкуронид эстриола; 2 - 3-фосфат эстриола; 3- P-D-глюкуронид
эстро* на; 4- 3-фосфат эсгрона; 5 - З-р-О-глю* куронид эстрадиола-17|5; 5
- 3-фосфат эстраднола-17р; 7 - 3-сульфат эстриола; 8 - 3-сульфат эстрона;
9 - 3-сульфат эст-
радиола-17^.
кость колонки значительно ниже, следовательно, эти материа-лы менее
приемлемы в качестве неподвижной фазы [37].
Фундаментальные исследования по разделению конъюгатов эстрогенов на
колонках с неполярными химически связанными неподвижными фазами на основе
силикагеля проведены ван дер Валом и Губером [37]. В табл. 11.9 обобщены
результаты их исследований зависимости коэффициентов емкости конъюгатов
эстрогенов от величины pH, концентрации солей и присутствия кислот и
оснований в метанольных буферных подвижных фазах.
Данные, приведенные в табл. 11.10 и на рис. 11.14, показывают, что
влияние природы органического модификатора на
Рис. 11.12. Зависимость коэффициента емкости k от температуры для
некоторых сульфатов эстрогенов [33] •
Колонка: 250X3 мм (внутр. дна*
метр); неподвижная фаза:
ECTEOLA-целлюлоза ЕТ 41 (11 мкм); элюент: 0.25 моль/л пер-хлората+0,01
моль/л фосфата, pH 8,5; обнаружение; при 220 нм.
1 - 17-сульфат эстриола; 2 - 3-сульфат эквилнна; 3 - 3-сульфат эстра-
днола-17а; 4 - 3,17-дисульфат эстра-диола-17р; 5 - 3-сульфат эстрадно*
ла-17|5.
Т,вС •
Таблица 11.6. Влияние различных катионов и анионов, содержащихся в
элюенте, па коэффициент емкости k конъюгатов эстрогенов [33]
Колонка: 250X3 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: ECTEOLA-целлюлоза В
300 (19 мкм); элюеит: 0,01 М фосфат (pH 6,8); обнаружение: по поглощению
при 220 нм; температура: 70 °С
Элюент
Конъюгат стероида [СЮ*---] NaCIOj NaHS04 NaNO.j NaCl к Cl
NH4CI MgCl2 nh4 Na Na Na Na
0,025 0, 100 0,100 0. 100 0, 100
0,100 0, 050 фосфат цитрат формиат ацетат пропионат
0, 500 0, 005 0, 100 0, 100 0, 125
(J-D-Глюкуронид тестостерона 0,54 0,41 0,29 0,35 0,36
0,36 0,37 1,12 0,42 0,37 0,42 0,36
З-^-О-Глюкуронид эстриола 0,76 0,63 0,50 0,58 0,62
0,60 0,63 1,27 0,68 0,61 0,68 0,58
P-D-Глюкуронид эстрона 1,03 0,74 0,59 0,67 0,71
0,69 0,72 1,72 0 74 0,68 0,77 0,67
