Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
тонкослойной и газо-жидкостнон хроматографии уже с момента их появления
играли важную роль в работах по химии стероидов. В последние же годы все
более широкое применение для разделения и идентификации стероидов
различной структуры находит высокоэффективная колоночная жидкостная
хроматография, имеющая ряд преимуществ по сравнению с перечисленными
методами. При этом широко варьируются условия разделения. Химия [1-4] и
методы анализа [5-8] стероидов подробно рассматриваются в ряде
монографий.
11.2. Андрогены и андростаны
Для андрогенов, мужских половых гормонов, характерно отсутствие боковой
цепи в положении Сп. На рис. 11.2 представлены структуры некоторых
андрогенов и их метаболитов.
Сиггиа и Дишман [9] более 10 лет назад разработали способ разделения
андрогенов на гидрофобных носителях, покрытых неполярной неподвижной
фазой, характеризующейся достаточно высокой разрешающей способностью
(табл. 11.1).
В работах [10-14] описан анализ андрогенов с использованием обращенно-
фазовых носителей с различной структурой и свойствами, включая ODS-
пермафазу, нуклеосил CN и Qg, ц-бондапак, лихросорб RP-8 и лихросорб RP-
18. Методом спектрофотометрии при длине волны 254 нм можно обнаруживать
до 1 нг стероидов.
Пять главных метаболитов тестостерона, образующихся под действием
микросомальной монооксигеназы печени, можно легко разделить методом
обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 11.3) [15].
(21)
Рис. 11.1. Структура холестана и общепринятая нумерация атомов углерода.
Рис. 11.2. Структура некоторых андростанов.
I - андрост-4-ен-3,П,17-трнон; 2 - андрост-4-еи-11Э-ол-3,17-дион; 3 -
андрост-4еи-П,17-дн' ои; 4 - тестостерон; 5 - аидростерон; 6 -•
эпиандростерон; 7-этиохоланолон; 8 -дегид-роэпиандростерон; 9 -
эпиэтиохолаиолои; 10-llp-гидроксиэтиохолаиолон; И - 110-гид-
роксиандростерои.
34-1489
530 Глава 11
Таблица П.1. Время удерживания некоторых андрогенов при
хроматографировании на амберлите LA-1 [9]
Колонка; 485X2 мм (виутр. диаметр); неподвижная фаза: 24% LA-laHa CTFE
'.терлолн-мер трифторэтилена), 325 меш; элюент: вода; объемная скорость:
0,25 мл/мнн, обнаружение: по поглощению при 250 нм
Стероид tR, МИН Относит. R
Андрост-4-ен-3,11,17-трион 6,53 2,05 0,765
Аидрост-4-еи-11 (5-ол-3,17-дион 7,98 3,10 1,16
ДМ-Андростадиен-^-ол-З-он 22,7 13,8 5,14
19-Норандрост-4-ен-3,17-дион 26,9 16,8 6,27
19-Нортестостерон 31,9 20,4 7,62
Андрост-4-ен-3,17-длон 57,2 38,8 14,5
Тестостерон 68,6 47,0 17,5
а н-Додеканаль(трнметнл)амнн.
Рис. 11.3. Хроматограмма смеси гидроксилированиых тестостеронов,
тестостерона и андростендиона, полученная методом ВЭЖХ [15].
Колонка: 250X4,6 мм (внутр.
диаметр); неподвижная фаза: С,а (10 мкм); элюент: вначале метанол/вода
(55 : 45). затем (показано стрелкой) метанол/во-да/ацетоннтрил
(55:35:10); обнаружение: при 240 нм: объем пробы: 10 мкл; концентрация
каждого нз стероидов в пробе, ммоль/л; 20-гндрокснтестостерон (23) 1,32.
60-гндрокситестостерон (6р) 0,33, 7а-гндрокситестосте-
рон (7а) 0.33, 16а-гидрокситесто* стерон (16а) 0.37, тестостерон (Т)
0,33 и андростенднон (А) 1,63.
Стероидные гормоны 531
t, мин-----"-
Рис. 11.4. Хроматограмма смеси андрогенов, полученная методом ВЭЖХ [20].
Колонка: 300X4,6 мм (внутр. диаметр), две секции; неподвижная фаза:
партиснл 5;
элюент: днхлорметан/ацетонитрил/2-пропанол (179:20; 1); объемная
скорость: 0,4 мл/мин; обнаружение: при 280 и 254 нм (два последовательно
соединенных детектора).
/ - 5а-андростан-3,17-днои (андростанднон) (37 мкг); 2 - 5Р-андростан-
3,17-дион (этно-холанднон) (39 мкг); 3 - андрост-4-ен-ЗД7-днон
(андростенднон) (34 мкг); 4 - Зр-гнд-рокси-5р-андростан-17-
он(эпиэтнохоланон) (196 мкг); 5 - Зр-гндроксиандрост-5-ен-17-он
(дегндрозпнандростерон) (188 мкг); 6 - Зр-гндроксн-5а-андростан-17-он
(эпнандростерои) (210 мкг); 7 - За-гндроксн-5а-андростан-17-он
(аидростерон) (214 мкг); ? -андроста-1,4-диен-3,17-дион (андростадиенон)
(6 мкг); 9 - 17р-гидроксиандрост-4-ен-3-он (тестостерон) (42 мкг); 10 -
За-гндрокси-5(3-андростаи-17-он (этнохоланолон) (297 мкг); 11 - 17а-
гидрокси-4-андростен-3-он (эпитестостерон) (99 мкг); ввод пробы
осуществлялся методом остановки потока.
Этот же метод, как показано в работе [16], посвященной ацетатам
некоторых 19-норстероидов (неподвижная фаза - ли-хосорб RP-8), пригоден
для разделения ацетатов андростанов с хорошим разрешением. Переводя
андростаны в соответствующие бензоаты, п-нитробензоаты [17] или 2,4-
динитрофенилгид-разоны [18], удается значительно снизить предел
обнаружения этих соединений УФ-детектором. Для обнаружения андростанов,
их сульфатов и глюкуронидов после разделения методом обра-щенно-фазовой
распределительной хроматографии на микропа-ке СН при элюировании смесями
метанол/вода [19] был применен рефрактометрический детектор. Элюирование
