Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
дезоксиинозин; 16 - 2'-дезокситнмидин; /7 - 1-метилннозин; 18 - N.-
метнлгуанозин; 19 - iN'j-мстилгуаиозин; 20 - кинуреновая кислота; 21 -
аденозин; 22 - теобромин; 23 - диметилгуанозин; 24 - теофиллин; 25 -
дифиллин; 26 - б-метиладенозин; 27 - индолнл-3-пропиоиовая кислота; 28 -
кофеин.
В работе [32] приведены данные о времени удерживания (табл. 9.1, см,
стр. 481), относительном поглощении (280/254 нм) и интенсивности
флуоресценции 86 нуклеозидов, азотистых оснований, нуклеотидов и других
соединениях.
Авторы работы [33] определили нуклеотидные профили кислотных
экстрактов тромбоцитов у здоровых и больных людей. Стандартные кривые,
полученные для каждого из трех основных нуклеотидов, имеют линейную форму
во всем изученном диапазоне концентрацией, а элюирование стандартов,
добавляемых в гомогенаты тромбоцитов, проходит эффективно и
воспроизводимо. Результаты определений, проведенных при помощи ВЭЖХ,
хорошо согласуются с полученными другими способами. Методика анализа
проста и дает хорошо воспроизводимые результаты и потому представляет
большой интерес в свете ее возможного использования для изучения
метаболизма нуклеотидов у больных.
В работе [34] опубликована методика определения на внутриклеточном
уровне свободных дезоксирибонуклеотидов. Авторы работы проводили их
разделение на колонке, заполненной лихросорбом-1МН2 при элюировании
калий-фосфатным буфером.
462 Глава 9
Порядок элюирования нуклеотидов был следующим: цитидин-б'-монофосфат,
аденозин-5'-монофосфат, уридин-5'-монофосфат" инозин-5'-монофосфат,
гуанозин-5'-монофосфат и ксантозин-5'-монофосфат. Эта методика позволяет
определять дезоксирибо-нуклеотиды в эпидермисе, что в свою очередь дает
возможность оценить биологические характеристики и роль метаболизма ДНК в
эпидермисе в норме, а также изменения, наблюдаемые при различных
патологических состояниях.
Для разделения и количественного анализа пуриновых и пиримидиновых
нуклеотидов авторы работы [35] воспользовались ВЭЖХ на ионнообменных
смолах. Этот метод может быть использован для анализа экстрактов
культивируемых линий лимфоидных клеток человека. Анализировать таким
способом можно (1-2)-10б клеток за 150 мин. После субкультивирования
быстро увеличивается содержание растворимых внутриклеточных нуклеотидов.
Однако это может быть обусловлено увеличением размеров клеток, а не
повышением внутриклеточной концентрации нуклеотидов. Различий в
содержании пуриновых нуклеотидов в нормальных клетках и клетках,
дефицитных по гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе, обнаружено не
было. Однако в клетках неожиданно высоким оказалось содержание
растворимых пиримидиновых нуклеотидов. Рост нормальных клеток подавлялся
гуанином или гуанозином в концентрации 5-10-5 или 10-4 моль/л
соответственно. Предполагают, что это вызвано заметным увеличением
содержания гуанозин-5'-три-фосфат-пула и уменьшением содержания
адениновых и пиримидиновых нуклеотидов.
В работе [36] представлен метод определения тканевого пула
уридиндезоксиуридина, цитидина, дезоксицитидина и моно-, ди- и
трифосфатов тимидина. Он предусматривает проведение иониого обмена и
разделение при помощи ВЭЖХ на препаративной колонке после превращения
нуклеотидов в нуклеозиды под действием кислой фосфата°ы. Обнаружение
осуществляется УФ-детектором при 254 и 280 нм. Выход составляет 80±2%,.
предел обнаружения 100 пмоль нуклеотида в пробе. Путем повторного
хроматографирования соответствующих фракций нуклеозидов предел
обнаружения каждого соединения можно снизить до 10 пмоль. Выход, включая
эту стадию, составляет 66±7%. Метод характеризуется хорошей
воспроизводимостью и высокой селективностью. Нижний предел
чувствительности составляет примерно 0,1 мкмоль/л для пробы ткани массой
150- 250 мг (влажная масса). Этот метод был использован для определения
содержания нуклеотидного пула в культурах клеток печени и лимфомы (S-49)
мышей (в последнем случае в среде
5-фторурацила или без него).
Метод определения 14 основных клеточных пуриновых рибо-нуклеодитов и
2'-дезоксирибонуклеотидов опубликован в работе
\
Азотистые основания, иуклеознды и нуклеотиды 463
[37]. Вначале исследуемую пробу фракционируют при помощи
анионообменной ВЭЖХ, далее нуклеотиды гидролизуют до соответствующих
нуклеозидов щелочной фосфатазой и полученную смесь разделяют методом
обращенно-фазовой ВЭЖХ с обнаружением по поглощению (УФ-детектор). Метод
характеризуется высокой воспроизводимостью и специфичностью, предел
обнаружения компонентов смеси составляет 10 пмоль в пробе. Выход
нуклеозидов, получаемых из нуклеотидов, составляет 85%. Пул пуриновых
нуклеотидов был определен в культуре клеток лимфомы Т (S-49) мыши до и
после 3-часовой обработки 2,0 мкМ микофенольной кислотой - ингибитором
фермента инозин-5'-монофосфат-дегидрогеназы. Контрольные уровни по
нуклеотидам, полученные данным способом, согласуются с результатами
исследования клеток S-49, проведенных при помощи других методов, и
