Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Применение этой методики в биохимических исследованиях изложено в работе
[8]-
Четыре компонента трех различных фрагментов ДНК (основания, нуклеозиды
и мононуклеотиды) были с хорошим разрешением разделены на колонке с
зорбаксом при элюировании 0,4 М NH4H2PO4, pH 3,5 (рис. 9.3) [9]. Эта
методика позволила определить состав азотистых оснований, содержащихся в
1 мкг ДНК Как выяснилось, разделение дезоксигуанозина и дезокси-тимидин-
5'-монофосфата, а также дезоксиаденозина и дезокси-аденозин-5'-
монофосфата в этих условиях проходит с плохим разрешением. Увеличение
длины колонки или же использование градиентного элюирования, по-видимому,
улучшает разрешение. Хроматографическое поведение аденина,
дезоксиаденозина и дезоксиаденозин-5'-монофосфата несколько отличается от
такового для других компонентов ДНК: время удерживания этих
Азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды 455
------^Ч,мин
Рис. 9.3. Разделение смеси азотистых оснований (а), дезоксирнбоиуклеознд-
5'-монофосфатов (6) и 2'-дезоксирибонуклеозидов (б) [9].
Колонка: 250X2,1 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: зорбакс ODS;
элюент: 0,4 М фосфат аммония (pH 3,5); температура: 40 °С; обнаружение:
при 240 им. а) I - цитозин; 2 - гуании; 3- тимии; 4 - аденин; б) 1 -
дезоксицитидин-5'-монофос-фат: 2 - дезокситимидии-5'-моиофосфат; 3 -
дезоксигуанозин-5'-моиофосфэт; 4 - дезокси-аденозии-б'-монофосфат; в) 1 -
дезоксицитидин; 2 - дезоксигуанозин; 3 - дезоксиадеио-зин: 4 -
дезокснтимндин.
трех соединений существенно увеличивается с увеличением pH элюента. Время
удерживания дезоксиаденозин-5'-монофосфата несколько меньше, чем аденина
и дезоксиаденозина. Время удерживания соединений уменьшается с
увеличением в элюенте концентрации фосфата аммония, тогда как на время
удерживания дезоксиаденозин-5'-монофосфата этот фактор или вообще не
оказывает влияния, или слегка увеличивает его. Изучение кривой
элюирования оснований с радиоактивной меткой показало, что небольшие
количества гуанина, тимина и аденина элюируются вслед за цитозином и что
зона адеина размывается. Это может служить причиной меньшего выхода этих
соединений. Более того, не исключено также, что рассматриваемый метод
может давать несколько завышенное содержание цитозина в ДНК.
В работе [10] описан метод селективного определения адено-зина в
присутствии других компонентов нуклеиновых кислот. Согласно этой
методике, разделение проводится на колонке, заполненной обращенной фазой
с частицами малого размера, при изократическом элюировании разбавленным
раствором дигидро-
456 Глава 9
фосфата калия и безводным метанолом. Селективное выделение аденозина
достигается менее чем через 10 мин. В работе приведен пример
использования этой методики в биохимических исследованиях.
Авторы работы [11] предложили методику быстрого количественного
определения содержания гуанина (G) плюс цитозина (С) в пробах ДНК после
гидролиза 88%-ной муравьиной кислотой. Для проведения анализа достаточно
10 мкг ДНК. Хотя тимин иногда плохо отделяется от примесей,
перемещающихся с фронтом растворителя, содержание (G + C) можно точно
установить, используя соотношение С/(А + С) или (G + C)/(2A + + G + C),
при условии что концентрация А известна. Содержание (G + C), найденное
при помощи ВЭЖХ, хорошо согласуется с данными, полученными исходя из
результатов определения температур плавления и плавучей плотности ДНК
десяти видов бактерий и двух грибов.
В работе [12] предложен экспресс-метод полного разделения четырех
тимидинОтимин димеров на колонке с обращенной фазой Cie и на новой
"кассетной" системе, разработанной фирмой Waters (RC-55). В этой же
работе описано разделение при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ оптически
активных стереоизомеров, а также изомеров жезо-циклобутадитимидина
(тиминовых димеров, Т< >Т). Тиминовые димеры представляют собой наиболее
характерный вид повреждений, индуцируемых в ДНК при облучении
биологических систем ближним и дальним УФ.
Разработан метод ВЭЖХ, позволяющий осуществлять контроль за
гидролитическим расщеплением 5-иодо-2'-дезоксиури-дина в водном растворе,
а также исследовать стабильность этого соединения [13]. Разделение 5-
иодо-2'-дезоксиуридина и продуктов его разложения проводят на колонке,
заполненной бондапаком Cis, при элюировании смесью метанол/вода. На
основании экспериментальных данных были установлены кинетический порядок
и константы скорости обеих последовательных реакций.
Группы уридин-5'-монофосфат, цитидин-5'-монофосфат, аде-нозин-5'-
монофосфат и гуанозин-5'-монофосфат, аденозин-5'-монофосфат, аденозин-5'-
дифосфат и аденозин-5'-трифосфат разделяют на колонке с обращенной фазой
в изократическом режиме элюирования в присутствии тетра-н-
бутиламмоииевого иона [14]. Отмечено, что 12 нуклеозиддифосфатов и
циклический аденозин-5'-монофосфат в изократических условиях не
разделяются, однако их можно выделить при градиентном элюировании,
увеличивая ионную силу и концентрацию метанола. Урацил, цитозин, аденин и
