Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 192

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 186 187 188 189 190 191 < 192 > 193 194 195 196 197 198 .. 296 >> Следующая

исследуемую пробу на ряд фракций, каждая из которых содержит по одному из
представляющих интерес компонентов, и провести разделение полученных
фракций также методом ВЭЖХ. Этот метод позволяет определять нанограммовые
количества соединений. Элюирование осуществляется в изократическом режиме
с использованием летучего растворителя, что позволяет автоматизировать
отбор проб или их лиофилизацию.
30*
468 Глава 9
9.3.3. Модифицированные компоненты ДНК и РНК
В основе механизма действия алкилирующих мутагенных и канцерогенных
агентов лежит их ковалентное связывание с ДНК. Замещение алкилирующими
агентами может происходить в пятнадцати различных точках нуклеофильных
азотистых оснований и фосфодиэфирного скелета ДНК- Как показали
исследования, мутагенной или канцерогенной активностью обладают лишь
некоторые продукты алкилирования ДНК. Например,
06-алкилгуанины играют активную роль в этих процессах, тогда как 7-
алкилгуанины в них не участвуют. О других продуктах алкилирования ДНК,
особенно недавно открытых О-алкилпи-ридинах, известно гораздо меньше, что
отчасти обусловлено отсутствием эффективных и доступных методов
разложения и фракционирования алкилированных форм ДНК- Однако, как
показали авторы работ [48-51], некоторые из продуктов алкилирования
оснований и фосфотриэфиров можно разделить при помощи ВЭЖХ, и этот метод
можно с успехом использовать для анализа гидролизатов ДНК (рис. 9.9).
В работе [52] описаны хорошо воспроизводимые методы анализа всех
известных метилированных или этилированных производных индивидуальной
ДНК. Продукты химического и ферментативного разложения фракционируют
путем объединения двух ВЭЖХ-систем, позволяющих осуществлять
количественное определение таких продуктов метилирования или этилирования
ДНК, как 1-, 3- и 7-алкиладенины, 02-алкилцитозины, 3-, О6- и
7-алкилгуанины и О2-, 3- и 04-алкилтимины, Ы6-Алкиладеиины, 1-
алкилгуанины и №-алкнлгуанины обнаружены не были, 3-ал-килцитозины были
идентифицированы, но не определены количественно. Содержание
фосфотриэфиров было установлено исходя из количества алкилфосфотриэфиров
тимидил-3'-5'-тимидина. Данный метод позволил определить 98, 81, 98 и 92%
алкильных групп, связанных с ДНК и полученных путем реакции ДНК с 14С-
метилметансульфонатом, 3Н-этилметансульфонатом, N-[3H]-метил-Ы-
иитрозмочевиной и Ы-[14С]-этилнитрозмочевиной соответственно.
Большинство молекул ДНК содержат незначительное количество оснований
(минорных оснований), которые метилируются после репликации ДНК. Для
прокариот и некоторых беспозвоночных эукариот такими минорными
основаниями являются 5-метилцитозин и (или) №-метиладенин. Во всех
исследованных ДНК позвоночных животных и высших растений обнаружено
только одно минорное основание - 5-метилцчтозин. Его содержание в
насекомых и бактериях составляет менее 0,05 моль. % общего содержания
оснований, а в ДНК высших растений достигает 7 мол. %.
Азотистые основания, иуклеозиды и нуклеотиды
469
t, мин
Рис. 9.9. Разделение пуринов [51].
Колонка: 250X0,4 мм; неподвижная фаза: партисил 10 SCX; элюент: 30 мМ
NH^HjPO* (pH 4.6); температура': 25X; объемная скорость: 1,2 мл/мии (6,42
МПа) в первые 27 мин и последующее увеличение до 2,1 мл/мии (10,86 М.Па);
обнаружение: при 254 им,
/ - гуаиии; 2 - 7-метилгуании; 3 - аденин; 4 - Ов-метилгуаиин;5 - 1-
метиладении; 5 - 3-метнладенин.
ДНК млекопитающих обычно содержит от 0,5 до 1,5 мол. % 5-
метилцитозина. Для определения содержания доминирующих и минорных
оснований и их общего содержания в ДНК предложен ряд аналитических
хроматографических методик, в том числе обращенно-фазовая хроматография
[9] и ион-парная хроматография на обращенной фазе [53]. В работе [54]
предложен метод определения всех шести дезоксирибонуклеозидов, не
требующий проведения гидролиза в жестких условиях, больших проб ДНК,
сложной предварительной подготовки пробы или введения метки в ДНК in
vivo. Этот метод отличается высокой чувствительностью, селективностью,
точностью и вопроизводи-мостью; он пригоден для исследования различных
видов ДНК, субфракций ДНК и для выяснения функций метилированной ДНК.
Пробы ДНК количественно гидролизуются ДНКазой I, нуклеазой Р1 и
бактериальной щелочной фосфатазой. Полученные дезоксирибонуклеозиды
используют непосредственно для разделения при помощи ВЭЖХ на обращенной
фазе (70 мин), обнаружение осуществляют по поглощению при 254 и 280 нм.
470 Г чава 9
Высокочувствительное и селективное количественное определение при двух
длинах волн значительно повышает точность и надежность результатов. РНК
гидролизуется одновременно с ДНК, однако это не влияет на результаты
анализа благодаря высокой разрешающей способности хроматографического
метода. В указанной работе описано количественное определение 5-
метилцитозина в 5 мкг препарата ДНК из тимуса теленка и из молоки лосося,
причем в последнем случае содержание 5-метилцитозина в ДНК не превышало
1-2%.
Обращенно-фазовая хроматография и ион-парная хроматография на
Предыдущая << 1 .. 186 187 188 189 190 191 < 192 > 193 194 195 196 197 198 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed