Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
гуанин, а также рибонуклеозиды этих оснований были разделены в
присутствии 10-камфаросульфонат-ионов.
Азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды 457
Рис. 9.4. Разделение смесн рнбоиуклеозид-5'-монофосфатов [17].
Колонка: 250X4,6 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: ультрасфср ODS;
элюент: 2,5 мМ тстра-бутиламмонийгидрокснд4-12% метанола, pH 2,5
(добавляют муравьиную кислоту); температура: комнатная; обнаружение: прн
254 мм.
/ - цнтнднн*5'-монофосфат; 2 - аденозин-5'-моно-фосфат; 3 - гуанознн-5'-
монофосфат; 4- урндин-5'-монофосфат; 5 - инозин-б'-минофосфат; 6 -
ксантозин-5'-моиофосфат.
Скорость разделения полярных растворимых в воде соединений на
обращенной фазе увеличивается в результате введения в систему алкилатов
четвертичного аммония, выполняющих роль противоионов при образовании
ионных пар [15, 16]. Ион-парная хроматография на обращенной фазе требует
по сравнению с ИОХ менее сложного хроматографического оборудования. Более
того, если разделение проводится по методу ИПХ, регенерировать колонку не
требуется, что существенно уменьшает длительность анализа. Шесть
природных 5'-рибонуклезидмоно-фосфатов были разделены при помощи
обращенно-фазовой ВЭЖХ путем элюирования смесями, содержащими ионы
тетраметил-, тетраэтил- или тетрабутиламмония (рис. 9.4), влияние которых
на эффективность разделения снижается в ряду бутил->этил->метиламмоний-
ион. Эти ион-парные реагенты влияют на разделение любых
нуклеозидмонофосфатов, если элюирование ведется кислым водным элюентом,
содержащим метанол. Следует отметить, что такой состав элюента фактически
обеспечивает количественный выход разделяемых нуклеотидов и облегчает их
выделение, так как все элюенты не содержат фосфатов и достаточно летучи.
Авторы работы [18] отделили распространенные адениновые нуклеотиды
(аденозинмоно-, аденозинди-, аденозинтрифосфат) при помощи ИПХ от их
сульфопроизводных (аденозин-5'-фос-фосульфат, аденозин-3'-фосфат-5'-
фосфосульфат) [18]. Никотин-амидадениндинуклеотидфосфат,
флавинадениндинуклеотид и аденознн-3',5'-бифосфат также удалось отделить
от их нуклеотидов прн помощи ИПХ при быстром изократическом элюировании,
вводя в состав элюента гидроксид тетрабутиламмония. Метод отличается
хорошими характеристиками, в частности хорошим значением коэффициента
емкости, и позволяет осуществлять непрерывное обнаружение в потоке 355-
меченых нуклеоти-
t, МИК
45^ Глава 9
дов. Он был использован для исследования кинетики действия фермента
аденозин-3'-фосфат:5'-сульфатофосфат-сульфотранс-феразы, принимающего
участие в процессе восстановления высшими растениями.
0.2.3. Аффинная хроматография
Для разделения азотистых оснований и нуклеозидов авторы работы [19]
использовали колонки, заполненные пористыми сферическими частицами смолы
диаметром 12-15 мкм с привитым тимином. Синтезируют такие смолы путем
суспензионной сопо-лимеризации глицидилметакрилата и
этиленгликольдиметакри-лата в присутствии разбавителя. Авторы указанной
работы осуществили разделение при комнатной температуре, элюентом служила
достиллированная вода. Сравнение удерживаемых объемов азотистых оснований
и нуклеозидов показало, что аде-нин и аденозин удерживаются наиболее
сильно, а гуанин и гуа-нозин удерживаются дольше, чем другие три
пиримидиновых основания или нуклеозиды пиримидиновых оснований. Более
того, удерживаемые объемы этих трех пиримидиновых оснований или трех
нуклеозидов пиримидиновых оснований существенно различаются, и разделить
пять оснований нуклеиновых кислот и пять нуклеозидов можно за короткое
время. Результаты исследований, проведенных с использованием в качестве
элюентов 1 М растворов хлорида натрия и мочевины и колонок, заполненных
указанной выше смолой и такой же смолой, но не содержащей химически
привитого тимина, позволяют сделать вывод, что между азотистыми
основаниями и нуклеозидами и неподвижной фазой, модифицированной тимином,
существует взаимодействие.
В литературе подробно описана методика разделения соединений, в
молекулах которых содержатся диольные группы (например, нуклеозидов,
нуклеотидов, катехоламинов, углеводов и тРНК), на боратзамещенной
полимерной неподвижной фазе. Вицинальные диольные группы способны, по-
видимому, к обратимому образованию циклических боратных эфиров. Прочность
эфирных связей зависит от pH, ионной силы, температуры и, если проводится
разделение компонентов нуклеиновых кислот, от структуры азотистого
основания, Авторы работ [20, 21] предложили использовать в ВЭЖХ для
разделения смесей нуклеозидов, нуклеотидов или углеводов в качестве
неподвижной фазы полихлортрифторэтилен (10 мкм) [20] или пористый
силикагель с химически привитой (ковалентные связи) 3-аминобензолбор-ной
кислотой (рис. 9.5).
Непосредственное определение нуклеозидов в плазме крови представляет
собой особенно трудную задачу вследствие их чрезвычайно низкого и
непостоянного эндогенного уровня у
Азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды 459
