Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
указывают, что после обработки клеток микофенольной кислотой содержание
гуаниновых нуклеотидов уменьшается, а содержание инозии-5'-монофосфата
увеличивается.
9.3.2. Азотистые основания, нуклеозиды и мононуклеотиды
Метаболизм пуриновых и пиримидиновых мононуклеотидов представляет собой
сложный биохимический процесс, играющий важную роль в функционировании и
размножении клеток. Изменение в тонкоконтролируемом содержании этих
метаболитов, вызываемое каким-либо генетическим нарушением или под
влиянием антиметаболитов, приводит к изменению клеточной функции, а
потенциально - к клеточной токсичности. Механизм этих изменений изучен
пока слабо. Очевидно, было бы желательно измерить изменение в метаболизме
мононуклеотидов, с тем чтобы выявить те механизмы, которые ведут к
нарушению клетки. Таким образом, одновременное определение всех пуриновых
и пиримидиновых метаболитов в клетках, полученных от людей с
соответствующими нарушениями, может дать ценную информацию. ВЭЖХ
позволяет разделить смесь, в состав которой входят все типы пуриновых
оснований, рибонук-леозидов и рибонуклеотидов, и определить
количественный состав смеси за один цикл [39], т. е. получить очень
важную для изучения метаболизма информацию [40]. После усовершенствования
данной хроматографической системы с ее использованием была разделена за
один цикл смесь, состоящая из пуриновых и пиримидиновых оснований,
рибонуклеозидов и рибонуклеотидов. Разделение проводилось на колонке
размером 700X1,8 мм, заполненной анионообменной смолой, при градиентном
элюировании раствором хлорида аммония (рис. 9.7). Длительность разделения
составила всего 160 мин. Потенциальные возможно-
464 Глава 9
t, мин
Рис. 9.7. Разделение оснований, нуклеозидов и нуклеотидов [41].
Колонка: 700X1,8 мм; неподвижная фаза: аминекс А-25: элюент: от 70 мМ
ЫагВ(0?/45 мМ NH"C1 в 2,5%-ном этаноле (pH 9,15) до 10 мМ ЫагВ^/бОО мМ
NH<C1 (pH 8,8). лниейный градиент, 15 мин; объемная скорость: 0,5 мл/мнн;
температура: 65 °С; обнаружение: при 254 нм.
/ - цитозин; 2 -цитндин; 3- тимидин; 4 - адеиозин; 5 - тимин; 5 - урацил;
7- гуаннн; 3 - адекик; 9 - урнднн; 10- гнпоксантин; //-ксантин; 12-
гуанозин; 13 - ниозин; 14 - цитидин-5'-монофосфат; 15 - тимиднн-б'-
монофосфат; 16 - ксантозин; /7 -• адено-зин-б'-монофосфат; 18 - уридин-
б'-монофосфат; 19 - цитидии-б'-днфосфат; 20 - гуанозни-б'-монофосфат и
тимидин-о'-дифосфат; 21 - инозин*5'-моиофосфат; 22 - аденознн-б'-дифоо-
фат; 23 - уридии-б'-дифосфат; 24 - цитидин-б'-трифосфат; 25 - тимидин-б'-
трифосфат: 26 - гуанозин-5'-дифосфат; 27 - уридин-б'-трифосфат; 28 -
аденозии-5'-трифосфат и ксан-тознн-б'-моиофосфат; 29 - гуанозин-5'-
трифосфат; 30 - аденилсукцииат.
сти применения данного метода для количественного выделения растворимых в
кислоте метаболитов фибробластов иллюстрирует рис. 9.8,
Преимущества рассмотренного выше подхода перед другими способами
анализа внутриклеточных пуриновых и пиримидино-ных производных
заключаются в возможности разделения и количественного определения
одновременно всех природных пуриновых и пиримидиновых оснований,
рибонуклеозидов и рибо-нуклеотидод. Этот метод был использован для
изучения метаболизма 41С-меченых пуриновых и пиримидиновых производных.
Одновременное измерение радиоактивности разных пулов дает ценную
информацию о функционировании метаболических путей, так как удельную
активность меченых метаболитов можно рассчитать. Приведенный выше режим
элюирования позволил отделить также некоторые дезоксипроизводные от
рибозопроиз-водных.
Авторы работы [42] предложили одноколоночную систему для
одновременного разделения оснований, нуклеозидов и нук-леозидмонофосфатов
и нуклеозидполифосфатов на основе высокопористого анионообменника аминекс
А-14. Разделение про-
О 20 40 60 80
100 120 140 160
О 20 40 60 80
100 120 140 160
t, МИН -----
-------
Рис. 9.8. Разделение кислоторастворимых пурииовых и пиримидиновых
метаболитов фибробластов здорового человека (а) и страдающего дефицитом
гп-поксантин-фосфорибозилтрансферазы (б) [41].
Условия разделения см. в подписи к рис. 9.7.
/ - цитидии; 2- адеиозин; 3 - тимин; 4 -урацил; 5 - адеиии; 6 -
гипоксантнн: 7 - ии-котииамидадеииидинуклеотид: 8 - ииозии; 9 -
цитндин-5'-моиофосфат; № - адеиозин-
5'-монофосфат; 11 - уриднн-5'-моиофосфат: 12 -
иикотинамидадеииндинуклеотидфосфат;
/? _ уридиидифосфатгалактоза и цитидии-5'-дифосфат; 14 - гуанозин-5'-
моиофосфат; to - ииозии-5'-моиофосфат; 16 - адеиозии-б'-дифосфат; 17 -
уридин-5'-дифосфат: 18 - ци-тидии-5'-трифосфат; 19 - гуанозин-5'-
дифосфат; 20 - уридин-5'-трифосфат; 21 - аденозин-б'-трифосфат; 22 -
гуаиозии-б'-трифосфа г.
30-1489
466 FjKiiio 9
водится при 55°С и щелочном pH в линейном градиенте ионной силы и pH и
