Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
обращенной фазе были использованы для определения 5-алкилурацила в
присутствии пуриновых оснований (в основном аденина) в гидролизатах ДНК,
полученной путем ферментативного синтеза [55]. С целью упрощения анализа
и сокращения его длительности было изучено влияние ионной силы, pH,
концентрации ион-парного реагента и метанола в элюенте на селективность
разделения алкилурацила и пуриновых оснований. В результате проведенной
работы были установлены оптимальные условия разделения в изократическом
режиме различных смесей, получаемых гидролизом продуктов ферментативного
синтеза.
Авторы работы [56] изучали влияние на разделение нативных и
модифицированных нуклеозидов на колонке с обращенной фазой бондапак Cis
ряда хроматографических параметров и в итоге разработали методику,
позволившую разделить за один хроматографический цикл восемнадцать
нуклеозидов. Авторы данной работы рассмотрели, в частности, влияние на
разделение объемной скорости подвижной фазы, pH, концентрации метанола в
элюенте, температуры колонки и объема вводимой "пробы. Каждый из этих
параметров изучался отдельно с тем, чтобы выявить его влияние на
хроматографическое поведение нуклеозидов. Исходя из установленного
влияния перечисленных параметров на элюирование нуклеозидов, можно
предсказать, как будет проходить их разделение. Проведенные исследования
позволили оптимизировать разделение нуклеозидов мочи в изо-кратическодо и
градиентном режимах.
Для разделения нуклеозидов из гидролизатов тРНК болеб удобно
ступенчатое градиентное элюирование, поскольку при этом происходит полное
разделение исходных рибо- и дезокси-рибонуклеозидов. Очень важное
значение имеет исследование влияния условий на процесс разделения
нуклеозидов при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ. Проведенные исследования
показали, что условия разделения нуклеозидов можно варьировать, исходя из
установленных корреляций. Данный хроматографический метод имеет особенно
важное значение при определении точного состава тРНК, особенно при
исследовании биосинтеза тРНК, ее функций, последовательности, а также при
Азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды 471
установлении степени чистоты выделяемых РНК и ДНК и исследовании ДНК и ее
модификацией.
В работе [57] опубликован метод количественного анализа основных и
модифицированных оснований в нефракционирован-ной тРНК печени крысы. тРНК
гидролизуют хлорной кислотой и полученные свободные основания разделяют
при помощи ВЭЖХ. Селективное обнаружение оснований в гидролизатах тРНК.
осуществляют при длинах волн, близких к их максимумам поглощения в УФ-
области. Выход индивидуальных оснований составляет 80-100%- Данные о
составе тРНК печени крысы, т. е. наименования десяти обнаруженных
оснований и их содержание, соответствуют полученным при помощи других
методов.
Авторами работы [58] предложен весьма несложный метод, особенно
удобный для исследований структуры тРНК, ее функции и биосинтеза, а также
для определения основных и модифицированных нуклеозидов в составе тРНК-
Этот метод имеет высокую чувствительность (нанограммовый уровень),
высокую разрешающую способность и селективность и позволяет
непосредственно проводить точное и надежное измерение содержания
нуклеозидов. Анализируемая проба не разрушается. Предложенная
хроматографическая система отличается высокой эффективностью, выделенные
очищенные нуклеозиды могут быть использованы для их последующего
исследования. Длительность разделения невелика (после гидролиза
исследуемого образца до нуклеозидов составляет около 1 ч). Для
количественного обнаружения не требуется введения радиоактивной метки,
хотя данный метод допускает разделение и обнаружение этих производных.
Предложен количественный метод определения положения и относительного
содержания радиоактивного изотопа в меченых нуклеиновых кислотах [59],
основанный на совместном применении ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Для
анализа достаточно около 1 мкг РНК. Чтобы сделать метод пригодным для
исследования нуклеиновых кислот, была проведена оптимизация условий
кислотного гидролиза тРНК с целью получения количественного выхода
оснований (без их расщепления), а также были подобраны соответствующие
условия разделения оснований при помощи ВЭЖХ. Этим методом были
исследованы три препарата тРНК, в состав которых введены in vivo [13Сг]-
аденин, [13Сг]-урацил и [13С]-метильная группа метионина. На основании
данных масс-спектрометрического анализа азотистых оснований этих
препаратов тРНК было установлено, что в их состав входит 27% аденина,
имеющего 13С-атомы в положении 2,43% урацила (13С-2), 45% цитозина (13С-
2), 56,9% тимина 13С (С-атомы находились в метильной группе).
Относительное же содержание в природной тРНК 13С-атомов составляет 1,08%.
Рас-
472 Глава 9
смотренный метод играет важную роль при изучении механизма биосинтеза
нуклеиновых кислот, а также модификации структуры при использовании ЯМР.
Природный модифицированный нуклеозид 3-[3-амино-3-кар-боксипропил]-1-
