Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
длится 225 мин. Данная система была использована для количественного
анализа клеточного пула нуклеотидов.
В литературе описан экспресс-метод для одновременного разделения и
количественного анализа аденозин-5'-трифосфата, аденозин-5'-дифосфата и
аденозин-5'-монофосфата [43], позволяющий осуществить надежное
определение содержания аде-нинрибонуклеотида в эритроцитах, а также
пригодный для многих методов ферментативного анализа, включая анализ
пуриновых компонентов.
Авторы работы [44] предложили ВЭЖХ-метод полного отделения
рибонуклеозидов от дезоксирибонуклеозидов и от оснований; длительность
разделения составляет 30 мин, предел обнаружения 1-5 нг. Элюирование
можно проводить при разных значениях pH различными буферными растворами,
например фосфатным с 2,5% метанола при pH 6,9 и 3,0 или 50 мМ нат-рий-
боратным, pH 9,0. Варьирование условий элюирования позволяет более четко
идентифицировать и количественно определить обычные метаболиты и
соответствующие им антиметаболиты. При изократическом элюировании была
разделена на отдельные компоненты смесь двадцати метаболитов.
Следовательно, в ряде случаев можно отказаться от градиентного
элюирования, сопровождаемого при увеличении концентрации бу-фера-элюента
дрейфом нулевой линии, особенно заметным в таких ситуациях, когда
детектор работает на максимальной чувствительности, необходимой для
определения содержания метаболитов. Данный метод потенциально пригоден
для количественного анализа метаболитов и антиметаболитов плазмы крови,
например l-^-D-арабинофуранозилцитозина, арабинофу-ранозилурацила и
фторопиримидина [44], причем без какого-либо предварительного обогащения
или предварительной обработки плазмы, что экономит время и уменьшает
вероятность потери или разрушения анализируемых соединений. Наличие
примесей эндогенных продуктов не влияет на разделение, идентификацию и
количественное определение метаболитов в плазме. Соответствующие
хроматографические колонки надежны в эксплуатации и сохраняют
стабильность в течение нескольких месяцев. Выбранные хроматографические
условия позволяют свести до минимума влияние нормальных метаболитов на
количественное определение пиримидиновых антиметаболитов.
Концентрации нуклеозидов и оснований в сыворотке крови человека
соответствуют их пределу обнаружения, поэтому контроль за изменением их
содержания в такой физиологически важной жидкости может быть использован
для построения профиля нуклеозидов и азотистых оснований и для изучения
их изменения при различных заболеваниях, в том числе опухолевых.
Очевидно, что для этого прежде всего необходимо распо-
Азотистые основания, иуклеознды и нуклеотиды
467
лагать данными о составе и концентрации нуклеозидов и оснований у
здоровых людей и их возможных изменениях в зависимости от пола, возраста,
диеты и т. д. Корме того, необходимо установить влияние условий
подготовки образца к разделению на стабильность его компонентов. Только
после проведения указанных предварительных исследований можно приступать
к сравнительному изучению состава сыворотки крови пациентов с различного
типа злокачественными опухолями и здоровых людей. ВЭЖХ на обращенных
фазах использовалась для исследования концентрационных кривых
низкомолекулярных соединений, поглощающих в УФ-области. Описанные в этой
работе методы обнаружения позволили идентифицировать пикомолярные
количества нуклеозидов, оснований и других соединений в нескольких
микролитрах ультрафильтрата сыворотки. Хроматограммы проб сыворотки крови
31 здорового человека (17 мужчин и 14 женщин) очень схожи. В сыворотке
здоровых людей идентифицировано и количественно определено 12 соединений.
Данные анализа сыворотки 150 пациентов с различными типами опухолей и
другими болезнями показывают, что концентрационные профили существенно
отличаются от таковых, полученных для здоровых людей.
Авторами работы [46] предложен скоростной метод разделения (и
выделения), идентификации и определения содержания пиримидиновых
оснований и нуклеозидов мочи при помощи ВЭЖХ. На первой стадии эти
соединения выделяют из мочи, используя небольшую сменную ионообменную
колонку. Далее проводят разделение по методу ВЭЖХ на колонке с
силикагелем при элюировании смесью метиленхлорида, метанола и 1 М водного
раствора формиата аммония. Онаружение осуществляют при 254 и 280 нм, а
для идентификации используют отношение сигналов и величины удерживаемых
объемов. Предел обнаружения составляет 0,2 нг урацила и 2,2 нг цитидина.
Диапазон линейности для добавленных в мочу тимина, урацила, ури-дина,
псевдоуридина, оротовой кислоты и оротина соответствует 1000-кратному
изменению их концентрации. Метод пригоден для диагностирования врожденных
нарушений цикла мочевины.
Применение ВЭЖХ на обращенной фазе с целью аналитического определения
нуклеозидов и оснований в плазме человека рассмотрено в работе [47].
Авторы этой работы предлагают вначале разделить при помощи ВЭЖХ
