Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
t, мин
Рис. 9.5. Разделение смеси рибо- и дезоксирибонуклеозидов [21].
Колонка; 100X5 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: силикагель с
химически привитыми боратными группами; элюент: 0,1 М фосфат натрия (pH
7,5); температура: комнатная; обнаружение: прн 260 нм. / -тимидин и
дезоксицитидин; 2 - дезок-сигуанозин; 3 - дезоксиаденозин; 4 - цитозин н
урндин; 5 -гуанозин; 6-адеиозии.
здоровых людей, а также вследствие маскирующего влияния других
компонентов плазмы. Как показали результаты исследований, борзамещенные
полимеры, например аффигель (Bio-Rad, Labs., США) [22] или бороник
асидгель (Aldrich, США) [23], пригодны для предварительного
фракционирования и концентрирования нуклеозидов плазмы крови, что
позволяет существенно повысить чувствительность, а также селективность их
последующего анализа при помощи ВЭЖХ. Во всех пробах, исследованных с
применением аффигеля, было с достаточной степенью надежности определено
содержание в плазме человека по крайней мере двух нуклеозидов (при
нормальном их уровне) - инозина и аденозина. Правильность идентификации
пиков и результатов количественной оценки содержания этих двух соединений
подтвердили данные, полученные при помощи метода ферментативного сдвига
пиков.
9.2.4. Растворимые комплексы металлов
Потенциальная пригодность для ВЭЖХ фаз с химически привитыми ионами
металлов показана относительно недавно [24, 25]. Для изучения
хроматографического поведения растворенных соединений, способных
образовывать внешнесферные комплексы с соединениями кобальта, была
приготовлена новая химически привитая фаза с Со(еп)33+ [26]. В качестве
контрольных соединений были выбраны нуклеотиды и нуклеозиды. Как
выяснилось, разделяемые соединения образуют довольно прочные комплексы с
неподвижной фазой, что значительно увеличивает время их удерживания, в
частности время удержива-
460 Глава 9
ния трифосфатнуклеотида. Добавление в подвижную фазу Mg(II) существенно
улучшило эффективность разделения и сократило его длительность при прочих
равных условиях. Хроматографические характеристики Со(еп)33+-фаз
сравнивались с аналогичными характеристиками обращенной фазы Cie и ди-
аминовой системы. Во всех трех случаях добавление Mg(II) в подвижную фазу
приводило к положительному эффекту.
9.3. Анализ компонентов нуклеиновых кислот в биологических объектах
Определение компонентов нуклеиновых кислот в биологических объектах
осуществляют при помощи различных методик ВЭЖХ, включая ионообменную и
обращенно-фазовую. Большинство таких методик предназначены для разделения
азотистых оснований и нуклеозидов [27, 28] или только нуклеотидов [20-31]
и предусматривают предварительное удаление из пробы сопутствующих
компонентов. Для характеристики различных типов ДНК и РНК большое
значение имеет анализ азотистых оснований и их нуклеозидов в гидролизатах
ДНК и РНК. Результаты определения содержания азотистых оснований и их
нуклеозидов в клеточных экстрактах в ряде случаев позволяют выявить
генетически обусловленные заболевания (синдром Лех-Нихана, дефицит
ферментов аденозин-дезаминазы или нуклеозид-фосфо-рилазы), приводящие к
изменениям метаболизма пурина и пиримидина. Более того, важную информацию
дает контроль метаболизма аналогов пурина и пиримидина, используемых в
качестве лекарственных препаратов при терапии раковых заболеваний.
Определенный интерес представляет также контроль за изменением содержания
нуклеозидов и азотистых оснований в сыворотке крови и моче (в первом
случае он позволяет диагностировать злокачественные новообразования, во
втором - различные типы злокачественных заболеваний).
9.3.1. Отдельные нуклеозиды и мононуклеотиды
Рядом исследователей было проведено тщательное изучение возможности
разделения при помощи ВЭЖХ содержащихся в сыворотке нуклеозидов,
азотистых оснований и других низкомолекулярных соединений, поглощающих в
УФ-области, Разделение проводилось на химически привитых тонкодисперсных
неподвижных фазах при градиентном элюировании смесями буферный
раствор/метанол, и в указанных условиях многие биологически важные
соединения удалось разделить с максимальной эффективностью при
минимальном времени разделения (рис. 9.6).
Азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды
46!
t.MH
Рис. 9.6. Разделение азотистых оснований, нуклеозидов, нуклеотидов,
ароматических аминокислот и их метаболитов (0,1-0,5 иМ) [32].
Неподвижная фаза: обращенная фаза С" на пористом силохроме (10 мкм);
элюеит: от 0.02 М К,Н2РО" (pH 5,6) до 60% метанола; линейный градиент;
0,69%/мин (0-60% метанола за 87 мин); объемная скорость: 1,5 мл/мнн,
температура: комнатная; обнаружение: при 254 нм; объем пробы: 40 мкл;
концентрация каждого из стандартов: 10-s М.
/ - цитозин; 2 оротидии; 3 - урацил; 4 - L-тирозин; 5 - цитидии; 6 -
гипоксантин;
7 - урндин; 3- 5-аминоимидазолкарбоксамидрибозиД; 9 - 7-метилинозин: 10 -
7-метил-ксянтозии; 11 - 7-метилгуанозии; 12 - р-
никотииамидадениндинуклеотид; 13 - ннозни; 14 - гуанозни; 15 - 2'-
