Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
большинства обращенных фаз, полученных обработкой октадецилсиланом
(RPCis), степень покрытия поверхности достигает 3,0-3,5 мкмоль/м2. На
каждую группу Cie приходится 0,5 нм2 поверхности, расстояние между
соседними группами С^ составляет примерно 0,7 нм. Площадь, занимаемая
одной силанольной группой на поверхности силикагеля, равна примерно 0,2
нм2, а расстояние между силанольными группами 0,4 нм. Очевидно, что те
силанольные группы, которые не подверглись модификации, остаются
доступными для разделяемых соединений и могут влиять на их удерживание.
Воспроизводимость величины степени покрытия поверхности остается
хорошей до тех пор, пока используется одна и та же партия силикагеля
[51]. Вследствие тенденции силикагелей к образованию коллоидов и
особенностей процессов, происходящих при их хранении, часто не удается
добиться высокой воспроизводимости. Смешивание различных партий
силикагеля позволяет получать неподвижные фазы с воспроизводимым со-
4b Глава 2
Рис. 2.10. Сравнение хроматографических свойств обращенных фаз С[8
(условия и разделяемая смесь те же, что на рис. 2.9) [32].
держанием углерода. Однако различия в свойствах силикагеля и концентрации
силанольных групп могут быть причинами плохой воспроизводимости. В
результате некоторые изготовители не ставят себе целью получить
максимальную степень покрытия, а ограничиваются получением обращенных фаз
с определенным содержанием связанного углерода. Однако содержание
силанольных групп в разных партиях силикагеля может различаться, поэтому
данный критерий является в определенной степени условным. Кроме того, не
удивительно, что разделение, достигнутое на неподвижной фазе с
максимальной степенью покрытия, не удается воспроизвести на неподвижной
фазе с меньшей, но лучше установленной степенью покрытия. Эти проблемы
знакомы каждому, кто пытался сравнивать результаты разделения на
неподвижных фазах одного названия, но выпускаемых различными
изготовителями. Рис. 2.10 может послужить уроком тем, кто начинает
использовать обращенно-фазовую хроматографию.
Свойства обращенных фаз во многом обусловлены тем, чте они являются
продуктами взаимодействия силикагеля и алкил-силанов. Влияние привитых
алкильных групп отражает термин "гидрофобная селективность".
В первом приближении коэффициент емкости данного разделяемого
соединеия k увеличивается с увеличением связанного углерода на единицу
объема колонки. При одинаковой степени покрытия поверхности удерживание
возрастает с увеличением длины цепи привитой алкильной группы.
Максимальное удерживание обеспечивает привитая октадецильная группа.
Такие неподвижные фазы предпочтительны, если растворимость разделяемых
веществ в водном элюенте ограничена. Чтобы
Хроматографическая колонка
47
Рис. 2.11. Сравнение хроматографических свойств обращенных фаз С4 и С]8
на примере разделения кофейных кислот [52].
Неподвижная фаза: лихросорб Si 100, С* и С18; Элюент: вода/ук-. сусная
кислота (10 или 20 об. %): проба: / - хияяая кислота,
2 - хлорогеновая кислота, 3 - кофейная кислота; 4- л^кума* риновая
кислота, 5 - л-кумари* новая кислота. 6 - о-кумарино-вая кислота, 7 -
кумарин.
СНзСООН Hz0+20/SCH3C00H
получить одинаковое значение коэффициента емкости на обращенных фазах С18
и С", в первом случае в элюент следует добавить на 10% больше
органического компонента. Если возможно плохое разделение соединений
гомологического ряда, предпочтительнее использовать неподвижную фазу С)8,
поскольку селективность разделения на ней соседних членов гомологического
ряда выше. В то же время для разделения соединений, молекулы которых
имеют большой размер, высокую гидрофоб-ность и ограниченную растворимость
в элюенте с высоким содержанием органических добавок, рекомендуется фаза
с короткими привитыми цепями.
Селективность разделения зависит от состава элюента. Элюенты с высоким
содержанием органических ингредиентов (более чем 50% метанола или
ацетонитрила) полностью смачивают неподвижную обращенную фазу, и
относительное удерживание на них соединений - членов гомологических рядов
- увеличивается с ростом длины цепи привитых алкильных групп обращенной
фазы. При элюировании чистой водой подобные закономерности не
наблюдаются. Относительное удерживание не изменяется, а абсолютное
возрастает с увеличением длины цепи привитых алкильных групп вследствие
повышения степени модифицирования по углероду [50]. Рис. 2.11 позволяет
сравнить разделение некоторых производных кофейных кислот на обращенных
фазах С4 и Ci8 при элюировании обогащенным водой элюентом. Относительное
удерживание в обеих системах
48 Глава 2
одинаково. Чтобы компенсировать влияние повышенного содержания углерода в
фазе Cis, в элюент добавляют на 10% больше органического ингредиента, в
данном случае уксусной кислоты, коэффициент емкости при этом остается
постоянным.
Выше отмечалось (см. разд. 2.2.3.1), что для сравнения характеристик
