Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
свойства ионообменника. В то же время децилсульфат обладает свойствами
поверхностно-активного вещества и проявляет тенденцию к
мицеллообразованию, что приводит к снижению k. Подобные явления
ограничивают возможности применения гидрофобных ионных пар в водных
элюентах. Для гидрофильных ионных пар зависимость k от концентрации
противоиона выражена менее сильно. Подобные корреляции были отмечены для
процессов экстракции кислот четвертичными аммониевыми ионами,
различающимися по гидрофобности.
Алкилсулырат. ммоль/л
Рис. 2.18. Зависимость удерживания от природы противоиона и его
концентра* ции [511.
Неподвижная фаза: партисил
ODS; элюент: 0,05 М водный
раствор фосфата, pH 2.55, содержащий различные концентрации
противоионов* проба: адреналин [51].
Рис. 2.19. Удерживание ам-фолитов на сшитом полистироле при различных pH
Г70].
6
pH
10
12
Хроматографическая колонка 01
Влияние pH. Контроль ионизации реагентов - необходимое для ИПХ
условие. Влияние pH на коэффициент емкости валина и антраниловой кислоты
иллюстрирует рис. 2.19. Удерживание валина минимально при значениях pH,
близих к нейтральному- в условиях образования цвиттер-иоиов. При низких
значениях pH коэффициент емкости принимает более высокие значения, чем
при высоких pH: вклад недиссоциированной карбоксильной группы в
удерживание, вероятно, больше, чем вклад непротонированной аминогруппы.
Антраниловая кислота при нейтральных значениях pH не заряжена и сильно
удерживается на неподвижной фазе. Для заряженных форм кислоты при низких
или, напротив, высоких значениях pH коэффициент емкости имеет меньшие
значения, чем при нейтральных pH. Коэффициент емкости существенно
изменяется, если pH элюента имеет значение, близкое к величине рК
конечной группы кислоты или основания (рис. 2.19). Поскольку валин и
антраниловая кислота обладают свойствами как кислоты, так и основания,
такие изменения k происходят соответственно при высоких и низких
значениях pH.
Величину pKi определяют из зависимости k от pH [71, 72].
Селективность разделения кислот и оснований достигает максимального
значения в области их рЛь Однако вследствие того, что в этой же области
коэффициент емкости сильно зависит от pH, воспроизводимость результатов
разделения в данных условиях невелика. Дополнительные проблемы возникают
в том случае, если изменяют органический компонент элюента, поскольку pH
и p/Ci зависят от содержания в нем органической фазы. Как правило,
изменение pH примерно на 0,1 ед. приводит к изменению k на 10%.
Температура также оказывает влияние на pH и р/Сг, следовательно, в ИПХ
кроме pH необходимо тщательно контролировать и температуру.
Влияние состава элюента. Водные буферные растворы используют в
качестве элюента в ИПХ относительно редко. pH буфера изменяется в
присутствии органического компонента (если концентрация последнего
превышает 25%). При концентрации органического компонента 25-50%
эффективное значение pH примерно на 0,1-0,2 ед. ниже, чем измеряемое в
водном растворе при помощи стеклянного электрода [68]. Классические
определения понятий pH, буферной емкости, диссоциации не применимы, если
содержание органического компонента в водно-органических смесях превышает
50%.
Наличие органического компонента в элюенте оказывает сильное влияние
иа р/Cr разделяемых соединений f68]. Причина этого заключается в
изменении диэлектрической проницаемости элюента, а также во
взаимодействии разделяемых соединений с компонентами элюента. Величины
р/Cr органических ¦ кислот увеличиваются пропорционально увеличению
концентрации
62 Глава 2
метанола в элюенте. Однако ожидаемой обратной зависимости между
концентрацией метанола и диэлектрической проницаемостью не наблюдается.
Наиболее значительное изменение p/Ci наблюдается в том случае, если
концентрация метанола составляет 80 об. % и выше. Величина р/Cr бензойной
кислоты меняется при концентрации метанола 20-60 об. %; например,
Ap/Ci"0,4 при повышении концентрации метанола от 20 до 40%. Для
катионогенных кислот типа производных анилина минимальное изменение р/Cr
наблюдается при концентрации метанола 80%.
Увеличение ионной силы элюента также влияет на p/Ci, поскольку
диссоциация ионогенных групп увеличивается в соответствии с законом
действующих масс [72]. Повышение температуры от 20 до 60°С оказывает на
p/Ci незначительное влияние (Ap/Ci"0,l).
Выбирая органический компонент элюента, следует придерживаться тех же
правил, что и в обращенно-фазовой хроматографии (см. разд. 2.2.4.2).
Ацетонитрил предпочтительнее метанола, поскольку обладает несколько
большей сольватирую-щей способностью. Производные тетраалкиламмония лучше
сольватируются в ацетонитриле, следовательно, при разделении этих
соединений при помощи ИПХ и элюировании смесями, содержащими ацетонитрил,
результаты разделения зависят от состава элюента сильнее, чем при
элюировании водно-метаноль-ными смесями. Диметилсульфоксид отличается
