Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
элюирование не вызывает каких-либо серьезных затруднений, время жизни
колонки обычно больше.
Химически привитые фазы впервые были применены в колоночной жидкостной
хроматографии для получения гидрофобных распределительных систем [43].
Впоследствии они были использованы в ГХ [44, 45] и ВЭЖХ [46]. Появление
химически привитых фаз привело к настоящему буму в жидкостной
хроматографии, особенно в биохимическом анализе.
2.2.4.1. Получение и свойства обращенных фаз. Концентрация
силанольных групп на поверхности силикагеля составляет 7-8 мкмоль/м2 [28,
29]. В результате химической реакции между силанольными группами и хлор-
или алкоксигруппами алкил-силанов на поверхности силикагеля образуются
новые силокса-новые связи, и таким образом происходит присоединение
алкильных групп силанов к поверхности силикагеля. Осуществить
модифицирование всех поверхностных силанольных групп не представляется
возможным: в оптимальном случае в реакцию вступает около 50% групп.
Поскольку в молекулы алкилсила-нов могут входить одна, две или три
функциональные группы, реагирующие с кислотными силанольными группами,
встает вопрос, каким должен быть поверхностный слой модифицирующего
агента - мономерным или полимерным. Если обработку проводят монохлор- или
моноалкоксисиланами с тремя алкильными группами (обычно с двумя
метильными группами и одной алкильной цепью), полимеризация не
происходит, и поверхность покрывается мономерным слоем модифицирующего
агента. Если обработку проводят ди- или трифункциональными алкилсиланами,
все эти группы не могут взаимодействовать с поверхностью силикагеля
одновременно. В среднем в реакции участвует примерно 1,5 из 2 или 3 хлор-
или алкоксигрупп [47]. Кроме ковалентного связывания с поверхностью
силаны могут полимеризоваться в полисилоксаны как на поверхности (если
присутствуют хотя бы следы воды), так и в растворе. Образующиеся полимеры
тоже могут взаимодействовать с поверхностью силикагеля, что приводит к
существенному уменьшению эффективности колонки [48].
Отличить "мономерную" привитую фазу от "полимерной" можно, сравнивая
эффективность разделения на такой фазе с разделением на "голом"
(^модифицированном) силикагеле при условии равенства размера частиц. Если
эффективность одинакова, привитая фаза находится в "мономерной" форме,
если меньше, чем у немодифицированного силикагеля (в 3-4 раза),- в
"полимерной" [49].
44 Глава 2
поверхность сн,
силикагеля | 3
-ОН ¦+ Cl-S. -
сн3
-он -
Т3
-он + ci - s,- сн2-(сн2|-сн3 сн3
о - Si - ch2-ich2)- сн3
сн,
он
о -Si -СН2-(СН2)- СН3
СН,
•он ci ^сн3 + ъ.
-он Cl СН, -(СН,) -сн,
\ /
+ /ч
он Cl CH2-(CH2I1(J-CH3
-°\ СН3
Si
/ \
--Р си2-(сн2) - си3
0Н с>!з /СНг-СНгНб-^з \
-О ОН
затем реагирует с ТМХС или гмдс
Рис. 2.8. Схема реакции получения обращенной фазы.
На рис. 2.8 приведена схема реакции между силанами и силикагелем.
Непрореагировавшие хлоридные группы силана необходимо после гидролиза
удалить обработкой сильным силанизирующим реагентом, например
триметилхлорсиланом (ТМХС) или гексаметилдисилазаном (ГМДС). Для
получения неподвижной фазы, обеспечивающей хорошее и воспроизводимое
разделение, вторичная реакция силанизации обязательна. Ее также
рекомендуют для получения обращенных фаз на основе монофункциональных
силанов. Эти процедуры можно проводить в заполненной колонке, пропуская
через нее раствор ГМДС или другого активного силанизирующего агента в
толуоле при комнатной температуре. На рис. 2.9 показано влияние повторной
силанизации на результаты разделения углеводородов. Необходимо отметить,
что эта обработка не влияет ни на общее содержание углерода, ни на
относительное удерживание углеводородов, тогда как относительное
удерживание всех других умеренно полярных соединений меняется. Наиболее
сильные изменения наблюдаются для соединений с основными свойствами,
например для анилина.
Степень покрытия поверхности силикагеля алкильными группами
рассчитывают исходя из содержания углерода в связанной фазе [47, 50]. В
оптимальных условиях поверхностная
Хроматографическая колонка 45
Рис. 2.9. Изменение селективности после обработки ГМДС [.?2].
Неподвижная фаза: Cis до и после обработки ГМДС; элюент: метаиол/вода
(65,4/35,6 по массе); объемная скорость; 1 мл/мин; проба; 1 - D2O, 2 -
бензамид, 3 - фенол, 4 - 2-фе-нилэтанол. 5 - аинлин. 6 - нитробензол. 7 -
метиловый эфир бензойной кислоты, 8 - бензол, 9 - этиловый эфнр бензойной
кислоты, 10- толуол, И - этилбеязол.
концентрация модифицированных силанольных групп может достигать 4
мкмоль/м2. Эта величина уменьшается, если модифицирование проводят
силанами с длинными алкильными группами или большими молекулами. У
