Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
готовить очень тщательно. Как показывает наш опыт, лучше-
4-1489
50 Глава 2
Таблица 2.4. Приготовление двухкомпонентной элюирующей смеси метанол/вода
(1:1) для хроматографического разделения на обращенной фазе Си
к
Состав смеси Способ приготовления Содержание кате- фенол /i-кре
Н20, масс. % хин зол
1 : 1 50 г СНзОН+50 г Н20 50,0 0,33 0,72 1,36
(по массе)
I : I 50 мл СНзОН+50 мл НгО 55,9 0,47 1,03 2,С5
50 мл Н20+СНз0Н 54,7 0,44 0,97 1,90
до объема 100 мл
1 : I 50 мл СН30Н+Н20 17,0 0,51 1,П 2,24
до объема 100 мл
всего и проще всего путем взвешивания, при этом воспроизводимость
состава элюента достигает не менее чем 0,1%. Следует заметить, что в
литературе очень часто приводят лишь соотношение компонентов элюента,
забывая указать, какое это соотношение (весовое или объемное).
В табл. 2.4 на примере смеси метанол/вода (1:1) показано, какие
возможны отклонения при ее приготовлении, а также продемонстрирована
последовательность ошибок, допускаемых иногда при приготовлении смесей
только путем измерения их объемов (одним градуировочным цилиндром). В
зависимости от того, какой из компонентов наливали в цилиндр первым и
каким из компонентов заполняли цилиндр до необходимого объема,
соответствующие величины k существенно различаются из-за колебаний в
объеме компонентов элюента.
В обращенно-фазовой хроматографии при высоком содержании
органического растворителя в составе элюента наблюдается аномальное
поведение белков и полипептидов [56]. При добавлении органического
компонента к водному элюенту коэффициент емкости сначала уменьшается
(соответствует классической ситуации), но при содержании органического
компонента (например, ацетонитрила) около 30% увеличивается. Типичный
пример такой зависимости k от содержания органического компонента в
элюенте показан на рис. 2.12. Левая и правая ветви графика имеют большой
тангенс угла наклона, поэтому воспроизводимость результатов разделения
может гарантировать только тщательное и точное приготовление элюента.
Причины увеличения k с повышением концентрации органического компонента в
элюенте пока не выяснены. Возможно, оно обусловлено силанофильным
взаимодействием между разделяемыми соединениями и неподвижной фазой или
же структурными
Хроматографическая колонка 51
Рис. 2.12. Аномальное удерживание белков при увеличении элюирующей
способности элюента [57].
Неподвижная фаза: .и-бонда-пак С|я; элюент: буфер -
ацетонитрил (буфер: 13 мМ триэтиламмоиийфосфат, pH 2,95); проба: 1 -
ангиотен-
зин 11, 2 - ангиотензин I, 3 - В-цепь бычьего инсулина, 4 - бычий
инсулин: 5 - глюкагон свиньи.
Ацетснитр^л, %---*-
изменениями соединений, возникающими при увеличении кон-центрации
органической фазы. Разрушение пространственной структуры белков или
пептидов приводит к увеличению площади, занимаемой такими молекулами на
поверхности, и увеличению сил взаимодействия с поверхностью. Безусловно,
денатурация и преципитация очень больших биомолекул при высокой
концентрации органического компонента в элюенте могут ухудшать их
разделение и снижать выход. Отчасти избежать столь нежелательных
последствий можно, используя в качестве органического компонента элюента
пропанол, который обладает высокой элюирующей способностью и потому может
добавляться в меньших количествах, чем другие органические раство-рител
и.
Отрицательное влияние на разделение оказывает изменение вязкости
смесей вода/спирт или вода/ацетонитрил. Вязкость водно-метанольных
растворов достигает максимума 1,84 мПз-с (20°С) при 40%-ном (по массе)
содержании метанола. Максимальная вязкость смесей вода/м-пропанол
превышает 3 мПз-с (рис. 2.13). Изменение вязкости не влияет на
удерживание разделяемых веществ, однако меняет перепад давления в системе
и эффективность колонки (см. разд. 2.1.2). Вязкость можно снизить путем
увеличения температуры колонки.
Изменение температуры, однако, оказывает влияние на абсолютное и
относительное удерживание, поскольку меняется теплота сорбции. Для
стандартных разделительных систем (0,5<&<3) теплота сорбции составляет
10-20 кДж/моль, и с изменением температуры на 1 °С величина k меняется на
1--
16 32 to
!Я 55 V2 80
4*
52 Глава 2
растворителя
Рис. 2.13. Изменение вязкости водно-органическнх смесей [2].
2,5%. Следовательно, температура элюента, системы отбора пробы и колонки
должна тщательно контролироваться, так как только при этом условии
удастся получить воспроизводимые результаты.
